芪蛭胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤相关因子p-Akt、Cathepsin表达的影响∗

庄晓彤 段芳芳 鞠丽丽 孙晓伟 陆雪健 蒋希成△

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040）

缺血性脑卒中是一种由于大动脉或其分支血管阻塞导致血流不能流入大脑而引起脑组织急性损伤的脑血管类疾病［1］，是临床较为常见的、多发的重大疾病，具有高发病率、高死亡率、高致残率等特点。目前，临床治疗主要通过药物溶栓或介入等手段快速恢复大脑缺血缺氧状态。脑组织缺血后重获血流灌注或氧供应后，对脑组织产生的损伤作用是双向的，它既可挽救濒临死亡的细胞，又可加重细胞的损伤甚至死亡［2］，对此临床上缺乏有效的诊疗手段。近年来，中医药对脑缺血再灌注损伤（CIRI）的诊疗突显了越来越重要的优势，且随着细胞凋亡、自噬的发现，其在脑缺血再灌注损伤过程中的作用得到医疗科研工作者的高度重视。本实验通过对PI3K-Akt-mTOR信号通路相关因子p-Akt、Cathepsin B、Cathepsin D表达研究，进一步观察芪蛭胶囊对脑缺血再灌注大鼠神经功能的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

健康SPF级雄性SD大鼠60只，6～8周龄，体质量（200±20）g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK（辽）2015-0001。大鼠在实验室饲养适应1周，温度为（22±1）℃，湿度45%～55%，自由进食进水，12 h昼夜节律。动物实验操作参考《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 药物

芪蛭胶囊中药复方（院内制剂）：黄芪（批号170301）、丹参（批号180601）、烫水蛭（批号151003）、地龙（批号160101）、石菖蒲（批号180501）、郁金（批号180802）、川芎（批号180601）、当归（批号180102）、炙甘草（批号171001），生产厂家为黑龙江德顺长中药饮片有限公司。将药物煎煮后以旋转蒸发仪浓缩，根据人和大鼠体表面积折算药物使用量，煎煮浓缩为相当于生药1.27 g/mL的药液，4℃冰箱密封、保存。

1.3 试剂与仪器

自噬抑制剂3-MA（阿拉丁，批号M129496），LY294002（MedChemExpress（MCE，批号 HY-10108），PBS（双螺旋，批号P10033），TritonX-100（Beyotime，批号ST795），山羊血清（Solarbio，批号SL038），DAPI（Sig⁃ma，批号C1002），抗荧光淬灭剂（Solarbio，批号C0296-3），Western blotting及IP细胞裂解液（Beyotime，批号P0013），PMSF（Beyotime，批号ST506），细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（Beyotime，批号P0033），BCA蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime，批号P0011），30%Acr-Bis（29∶1）（Beyotime，批号 ST003），SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（Beyotime，批号P0015），ECL发光液（Be⁃yotime，批号P0018），预染蛋白分子量标准（Fermentas，批号 26616），PVDF膜（Millipore，批号 IPVH00010），BSA（Biosharp，批号BS043），脱脂奶粉（伊利，批号：Q/NYLB 0039S），p-AKT（CST，批号 4060），Cathepsin B（Proteintech，批号12216-1-AP），Cathepsin D（Protein⁃tech，批号21327-1-AP），山羊抗兔IgG（beyotime，批号A0208），内参抗体β-actin（Santa cruz，批号sc-47778）。脑立体定位仪（上海奥尔科特生物科技有限公司），台式牙钻机（上海齿科医械厂），微量注射器（镇江康利医疗器械有限公司），电热恒温培养箱（天津泰斯特仪器有限公司），酶标仪（美国BIOTEK），转移槽（北京六一生物科技有限公司），双垂直蛋白电泳仪（北京六一生物科技有限公司），凝胶成像系统（北京六一生物科技有限公司），超速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.4 分组与给药

给予常规饲料、双蒸水适应性饲养7 d后观察各组大鼠的状态，剔除状态不佳的大鼠，并及时补充新鼠。按随机数字表法将60只大鼠分为假手术组、模型组、3-MA组、LY组、中药组，每组12只。中药组每日给予芪蛭胶囊2.5 mL药液灌胃，其余各组给予等量生理盐水灌胃。每日1次，连续7 d。3-MA组于造模前24 h侧脑室注射3-MA溶液10 μL（3 μg/μL），LY组造模前30 min腹腔注射LY294002溶液10 mg/kg，取材前2.5 h再注射1次。

1.5 模型制备

各组大鼠灌胃7 d，第8日参照改良Zea Longa法［3］，制备大鼠大脑中动脉阻塞模型（MCAO）。术前大鼠禁食24 h，腹腔注射2%戊巴比妥钠（0.3 mL/100 g）麻醉，仰卧位固定于手术台上。用镊子撑开大鼠的嘴，夹出舌头，开放气道。备皮消毒后于大鼠颈部正中线偏右处做一2.0～2.5 cm的纵向切口，钝性分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），分离时应注意保护沿血管的神经。在近心端结扎CCA、ECA，用动脉夹暂时夹闭CCA远心端，然后在CCA近心端距分叉部4 mm处用眼科剪剪一小口，将带有石蜡头的线栓插入到CCA，系牢线栓，用镊子轻推栓线至分叉处，松开动脉夹，使线栓从血管分叉处进入ICA，至线栓中部标记点到达分叉位置附近，插入长度约为（18±2）mm，于CCA远心端用细线结扎。剪断结扎在CCA、ECA的多余线头，消毒后缝合切开皮肤。术后2 h进行再灌注，将栓线拔出约1 cm左右，以防出血。术后大鼠饲养于SPF级动物实验室24 h，自由进食饮水。假手术组仅将CCA、ECA、ICA游离，不插入线栓，其余步骤同其他组。在手术期间及术后，采用保温措施将大鼠体温维持在（37.0±0.5）℃。

1.6 神经功能评分

各组大鼠CIRI 24 h后，采用神经功能评分（NSS）量表评估功能神经受损程度，以确定大鼠MCAO后的运动、感觉、平衡和反射障碍等［4］。NSS评分共18分，分值越高，神经功能缺损程度越重。神经损伤评分分级如下：严重损伤（13～18分），中度损伤（7～12分），轻度损伤（1～6分），无损伤（评分为0）。

1.7 标本采集与检测

1.7.1 脑组织含水量测定 各组大鼠完成神经功能评分后，每组取5只大鼠，快速断头取脑，去除小脑和脑干。用电子天平称取标本的湿重，然后将脑组织置入电热恒温培养箱（100±2）℃中烘24 h至恒重，称取干重。采用干、湿比重法计算脑组织含水量，脑含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.7.2 Western blotting法检测大脑组织中p-Akt、Ca⁃thepsin B、Cathepsin D表达水平 各组取7只大鼠再灌注24 h，断头取脑，缺血区脑组织冷冻后研磨，加适当量的裂解液，冰上静置30 min，4℃低温冷冻离心机10 000 r/min离心5 min，取上层清液（大脑组织总蛋白样品）。应用BCA法蛋白定量，酶标仪读数并记录。以RIPA调整蛋白浓度，根据目的蛋白分子量配制15%分离胶，浓缩胶浓度为5%，上样，SDS-PAGE电泳，5%TBST中室温，一抗（兔抗AKT抗体1∶500）4℃孵育过夜，二抗［山羊抗兔IgG（H+L）HRP，1∶10000］，摇床摇动5 min。转膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，经脱脂奶液封闭、TBST洗膜后，加入Akt二抗（1∶1000）。用ECL化学发光试剂检测蛋白表达水平，用凝胶图像处理系统（Gel-Pro-Analyzer软件）分析目标条带的光密度值。以β-actin为内对照标准化后，比较其表达量的变化。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠NSS评分比较

见表1。假手术组大鼠没有表现出神经功能受损。其余各组在CIRI 24 h均出现不同程度的神经功能缺损，与假手术组比较均有显著差异（P<0.05），中药组与模型组比较神经功能评分降低（P<0.05）。提示芪蛭胶囊可减轻CIRI大鼠的神经损伤。

2.2 各组大鼠脑组织含水量比较

见表1。假手术组大鼠无脑水肿表现。CIRI 24 h后，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织含水量显著升高（P<0.05）；与模型组、3-MA组、LY组比较，中药组脑组织含水量明显降低（P<0.05）。提示芪蛭胶囊可降低CIRI大鼠的脑组织含水量。

表1 各组大鼠NSS评分及脑组织含水量比较（±s）

表1 各组大鼠NSS评分及脑组织含水量比较（±s）

注：与假手术组比较，∗P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与中药组比较，△P<0.05。下同。

组别假手术组模型组3-MA组LY组中药组n 12 12 12 12 12 NSS评分（分）0.00±0.00 11.83±0.68*#14.15±0.32*#△12.26±0.17*#△9.92±0.08*#n55555脑含水量（%）78.18±0.10 82.81±1.05*△83.55±1.17*△83.18±0.86*△81.53±2.01*#

2.3 各组大鼠脑组织相关因子p-Akt、Cathepsin蛋白表达比较

CIRI 24 h，与假手术组相比，其他各组p-Akt蛋白表达均减少（P<0.05），与模型组相比，3-MA组、LY组、中药组中p-Akt蛋白表达减少（P<0.05），但与3-MA组、LY组相比，中药组中p-Akt蛋白表达有所增加（P<0.05）。CIRI 24 h，与假手术组相比，其他各组Ca⁃thepsin B蛋白表达均增加（P<0.05），与模型组相比，中药组中Cathepsin B蛋白表达显著增加（P<0.05）。CIRI 24 h，与假手术组相比，其他各组Cathepsin D蛋白表达均增加（P<0.05），与模型组相比，中药组Ca⁃thepsin D蛋白表达显著增加（P<0.05）。结果见图1～图3，表2。提示芪蛭胶囊可降低p-Akt蛋白的表达，增加Cathepsin B、Cathepsin D蛋白的表达，进一步激活自噬。

图1 各组大鼠脑组织p-Akt蛋白表达

图2 各组大鼠脑组织Cathepsin B蛋白表达

图3 各组大鼠脑组织Cathepsin D蛋白表达

表2 各组大鼠脑组织p-Akt、Cathepsin蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠脑组织p-Akt、Cathepsin蛋白表达比较（±s）

组别假手术组模型组3-MA组LY组中药组n 7 7 7 7 7 p-Akt 1.00±0.00 0.48±0.02*0.30±0.01*#△0.20±0.04*#△0.44±0.01*#Cathepsin B 1.00±0.00 2.90±0.01*2.65±0.03*#△4.10±0.02*#△4.16±0.05*#Cathepsin D 1.00±0.00 3.27±0.02*2.01±0.04*#△4.21±0.03*#△4.29±0.06*#

3 讨 论

张仲景于《金匮要略》首载中风之名，其曰“脉微而数，中风使然”，认为正虚邪中为中风病因；清代医家王清任提出“气虚致瘀”之论点，并创立益气活血的经典名方——补阳还五汤；张锡纯亦言“气血虚者，其经络多瘀滞……以化其瘀滞，则偏枯痿废者，自愈也”。古今医家对于中风病因病机的认识已基本趋于一致，认为是本虚标实，气虚为本，血瘀为标，瘀血既成，又影响气的生血及行血，使脑络瘀阻加重，易发为中风，治疗多以益气活血为治疗大法。笔者课题组在总结前人经验的基础上，又依据现代人高脂肪、高热量饮食的生活习惯，易致脾虚而生痰，认为缺血性脑中风的主要病机为气虚血瘀夹痰，气虚为本，血瘀痰浊为标；气虚无力运血则发为血瘀，而瘀血阻碍气机，水液代谢失常，气滞湿阻，聚湿为痰；痰瘀既为病理产物又为致病因素，痰瘀互结阻滞人体气血运行，壅塞脑窍，发为中风。基于此提出益气活血、祛瘀通络化痰的治疗大法，拟定芪蛭胶囊中药复方治疗缺血性中风，并在临床应用中取得了显著疗效。方中重用黄芪为君，大补元气，气足则血生，气旺促血行；臣以虫类水蛭、地龙之品，破血逐瘀、通经活络，石菖蒲、郁金化痰祛瘀，开窍醒神；佐以丹参、当归、川芎共奏补血、活血之功，使以炙甘草调和诸药。诸药合用，共奏攻补兼施、扶正祛邪之功。本课题组在前期实验研究发现［5-7］，芪蛭胶囊对大鼠局灶性脑缺血具有保护作用，能保护脑组织神经元内线粒体功能，抑制PKC-MARCKS信号通路的激活及小胶质细胞的生成，进而减轻CIRI损伤。

近年来，自噬作为新发现的程序性细胞死亡方式［8］，在脑缺血再灌注中的参与作用逐渐得到重视。有研究表明，CIRI的整个过程中均有自噬的参与，且脑缺血再灌注后自噬激活就像一把双刃剑［9］，适度激活可对细胞损伤起保护作用，过度的自噬可诱导自噬性细胞死亡。CIRI后，多种信号通路参与了调控自噬过程，其中PI3K-Akt-mTOR信号通路在自噬的调控中扮演了核心角色［10］。自噬的整个过程是由自噬相关基因家族调控，组织蛋白酶（cathepsins）、Akt蛋白等扮演着重要角色。丝苏氨酸蛋白激酶（Akt）是PI3K的下游效应物，能介导多种生物学效应，I型PI3K催化生成PIP3，进而通过诱导AKT活化而抑制自噬［11］。本实验结果表明，中药组神经功能评分明显降低（P<0.05），脑组织含水量降低（P<0.05）；Western blotting结果显示，模型组大鼠p-Akt表达较假手术组降低，自噬激活，中药组p-Akt表达进一步降低，表明自噬被进一步激活，证实了中药芪蛭胶囊通过激活自噬而减轻了缺血缺氧的脑组织损伤。

Cathepsin是一种广泛存在的嗜酸性溶酶体蛋白水解酶，在神经细胞内以酶原的形式贮存在溶酶体中。自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，自噬体内膜及其包裹的物质进入溶酶体腔，被溶酶体中的酶水解［12］。Cathepsin作为溶酶体的标志物，通过选择性水解靶蛋白肽键而参与自噬进程［13］。在大鼠缺血性卒中后6 h即可检测到Cathepsin的表达，同时伴随LC3-Ⅱ的表达上调，可以显著减少大鼠脑梗死面积［14］。Cathepsin D是是溶酶体最主要的蛋白水解酶之一，可降解自噬溶酶体以维持细胞的稳态［15］。Cathepsin D可激活Cathepsin B、H、L的酶原形式［16］。Felbor等［17］报道Cathepsin B和Cathepsin L在维持中枢神经系统正常功能方面起重要作用。薛杭［18］研究发现缺血缺氧后24 h，新生大鼠左侧海马区溶酶体蛋白酶Cathepsin B表达增高。本实验结果显示，模型组大鼠Cathepsin D、Cathepsin B表达水平明显高于假手术组，提示自噬小体促进了溶酶体活化，完成自噬溶酶体降解的过程，中药组Cathepsin D、Cathepsin B表达量较模型组进一步增加，结合p-Akt蛋白中药组表达结果，认为自噬小体增加使蛋白水解酶表达增加，自噬进一步活化，从而有效保护缺血缺氧的脑组织细胞。

综上所述，本实验通过对大鼠脑缺血再灌注损伤相关因子p-Akt、Cathepsin D、Cathepsin B表达研究，阐明了芪蛭胶囊可进一步激活自噬而减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的分子机制，对大鼠脑缺血再灌注损伤起到神经保护作用。