免疫功能正常者新生隐球菌感染1例报道

王东江， 郭 建

（上海市东方医院南院检验科，上海 200120）

可引起感染的隐球菌主要包括新生隐球菌和格特隐球菌，常见的感染部位是中枢神经系统、肺部和皮肤。隐球菌主要引起免疫抑制患者的感染，其发病率约为6～10%，获得性免疫缺陷综合征患者隐球菌病的发病率更可高达30%[1]。在免疫功能正常的人群中，隐球菌的感染率则很低，仅有十万分之一感染的可能，早期诊断对预后至关重要[2]。耐药性的产生是导致临床抗隐球菌感染治疗失败的重要原因之一。近年来，隐球菌属对氟康唑的最小抑菌浓度明显升高[3]，及时、规范的真菌药物敏感性试验结果对精准治疗具有重要意义。发病隐匿、病死率高是隐球菌性脑膜脑炎的重要特征[4]。本研究对1例免疫功能正常的中年男性隐球菌感染病例的诊断与治疗过程进行分析，为临床合理选择诊断项目，提高检验路径的临床应用提供实验室依据。

1 病例资料

患者，男，46岁。10年前曾患胃炎，平素体健，无药物过敏和慢性病史，无传染病及手术外伤史，否认有鸽子接触史。1周前无明显诱因开始出现发热、咳嗽、咳白色黏痰，伴有胃反酸、头痛、畏寒。2019年7月23日来上海市东方医院南院急诊内科就诊，体温37.5 ℃，予以左氧氟沙星、头孢美唑抗感染治疗，奥西康抑酸护胃等对症支持治疗。治疗5 d后症状未见明显好转，仍有反复发热，且近2 d出现腹泻。7月30日因“发热伴咳嗽、咳痰1周”入院。入院影像学检查示：脑部未见明显可疑感染症状，左肺上叶小结节，双侧胸膜局部小结节样增厚，双肺少许纤维灶，见图1。

图1 脑部和胸部影像学检查结果

患者入院后完善相关检查，呼吸内科先后予以莫西沙星0.4 g qd、盐酸万古霉素1 g q12 h静滴进行抗感染治疗。8月3日，患者反复发热伴头痛，腋窝淋巴结增大，双侧腹股淋巴结增大。考虑患者发热与病毒感染有关，给予比阿培南、地塞米松及更昔洛韦继续抗感染、抗病毒对症支持治疗，同时给予甘露醇降颅压。

2019年8年5日，考虑颅内感染转入神经内科，给予更昔洛韦、头孢曲松钠抗感染治疗，脱水利尿。8月7日出现颈项强直、四肢抽搐，突发颈项强直，脑膜刺激征阳性，脑电图中度弥漫性异常。行腰椎穿刺，脑脊液压力35.0 cm H2O，脑脊液墨汁染色检查危急值报告提示“查见大量有荚膜的酵母样真菌孢子，疑似隐球菌感染”，转入重症监护病房后调整用药方案，给予氟康唑抗真菌感染治疗。患者伴有发热，考虑真菌血症，采集双侧双瓶血培养送检，同时采集脑脊液进行细菌和真菌培养。

临床微生物实验室进行真菌培养鉴定和体外药物敏感性试验，结果提示棘白菌素耐药，氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、5-氟胞嘧啶和两性霉素B根据流行病学折点（epidemiological cutoff value，ECV）判读为敏感[5]。邀华山医院感染科专家会诊后，应家属要求转入华山医院感染科住院治疗。治疗方案为两性霉素B用药至累积2.5 g，调整方案为氟康唑600 mg qd联合5-氟胞嘧啶1.5 g qd口服。对患者随访6个月，患者用药期间无明显不适，腰椎穿刺、血常规、肝肾功能、电解质未见明显异常，预后良好。

2 实验室检查

8月3日，巨细胞病毒抗体、单纯疱疹I型IgG抗体检测均为阳性。脑脊液用细胞离心机771×g离心20 min后制片，烤干玻片后进行革兰染色。脑脊液771×g离心20 min，弃上清，取沉淀进行真菌荧光染色和墨汁染色。同时，对脑脊液上清液进行隐球菌荚膜抗原快速检测。将5 mL脑脊液注入需氧血培养瓶内增菌，同时采集双侧双瓶血培养瓶置Versa TREK240全自动血培养仪（美国赛默飞世尔公司）培养。对血培养和脑脊液培养分离出的新生隐球菌进行快速质谱鉴定和体外药物敏感性试验。

脑脊液常规检查结果为无色、透明，白细胞547×106/L，中性粒细胞42%，单核细胞5%，淋巴细胞53%，红细胞计数1 000×106/L，潘氏试验结果为阳性。脑脊液生化检测结果显示葡萄糖＜1.10 mmol/L，氯112 mmol/L，总蛋白1 240 mg/L。隐球菌荚膜抗原快速检测阳性。取1 mL脑脊液通过细胞离心机制片后行革兰染色，查见大量酵母样真菌孢子。真菌荧光染色找到真菌孢子，隐球菌墨汁染色查见大量有荚膜的酵母样真菌孢子，疑似隐球菌。见图2。

图2 新生隐球菌墨汁染色、革兰染色、相差显微镜和荧光染色结果

脑脊液和血培养瓶分别培养24～48 h，血培养仪器提示阳性，将培养物转种哥伦比亚血平板、巧克力平板、麦康凯平板和沙保弱平板（美国赛默飞世尔公司）。35 ℃培养24 h后，采用Autof ms1000全自动微生物质谱检测系统（郑州安图公司）进行菌株鉴定，腹腔积液3次检测结果均为新生隐球菌（Cryptococcus neoformans），鉴定分值均>9.50。

参照2017年美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）要求进行隐球菌药物敏感性试验，采用YeastOne真菌药物敏感性试验试剂盒（美国赛默飞世尔公司）进行检测，72 h后使用SensititreVizion全自动药物敏感性试验判读系统判读结果。同时，进行近平滑念珠菌（ATCC 22019）和克柔念珠菌（ATCC 6258）药物敏感性试验质量控制，24 h质量控制检测结果均在控。参考隐球菌属微量肉汤稀释法常规药物敏感性试验ECV值[5]（表1），≤ECV值判读为野生型，>ECV值判读为非野生型。对该菌株的药物敏感性试验结果进行判读：氟康唑4 μg/mL（野生型）、伊曲康唑0.03 μg/mL（野生型）、泊沙康唑0.03 μg/mL（野生型）、两性霉素B 0.5 μg/mL（野生型）、5-氟胞嘧啶1 μg/mL（野生型）、伏立康唑0.015 μg/mL（野生型），米卡芬净8 μg/mL（天然耐药）、阿尼芬净8 μg/mL（天然耐药）和卡泊芬净8 μg/mL（天然耐药）。

3 讨论

隐球菌广泛分布于土壤、鸽粪等自然环境中，是常见的条件致病性真菌。通过呼吸系统进入人体发生定植和感染，可累及中枢神经系统、呼吸系统、皮肤、骨骼系统和血液系统等，对脑和脑膜有特殊的亲和力。隐球菌性脑膜脑炎是由隐球菌侵犯中枢神经系统引起的一种深部侵袭性真菌病，多见于免疫功能受抑制和免疫功能低下的患者，免疫功能正常者罕见发病[6-9]。

隐球菌性脑膜脑炎的临床表现多无特异性，影像学诊断也缺乏特异性。常表现为进行性头痛加剧，病程迁延，常伴有恶心、呕吐及视力障碍。肺部感染常见多发性结节，隐球菌荚膜抗原快速检测可以早期快速筛查隐球菌肺部感染。目前，脑脊液真菌培养鉴定仍是鉴定隐球菌性脑膜脑炎的唯一“金标准”[10-11]。隐球菌性脑膜脑炎的临床表现和实验室检查与结核性脑膜炎极为相似，临床容易误诊[8，12]。本例患者系平时体健中年男性，无基础疾病，急性起病，持续头痛伴发热，症状逐渐加重，病情进展快，符合隐球菌性脑膜脑炎的表现，临床上比较罕见。

有学者对1 049例艾滋病患者的血液和脑脊液样本进行检测方法学比较后发现，血清隐球菌抗原检测是诊断隐球菌感染的理想方法[11]。对误诊隐球菌性脑膜脑炎的回顾性分析发现，4例患者均以头痛起病，病程中均出现发热，被误诊为病毒性脑膜炎、结核性脑膜炎及上呼吸道感染各1例。最终通过脑脊液墨汁染色检出新生隐球菌，确诊为新生隐球菌性脑膜脑炎[12]。近年来，隐球菌性脑膜脑炎和隐球菌性肺炎的发病率有不断升高的趋势，临床应提高与病毒性脑膜炎或肺炎等疾病相鉴别的能力，选择合适的检测项目，早期快速确诊。对疑似隐球菌感染的患者，血清隐球菌荚膜抗原检测和脑脊液墨汁染色可提高诊断的及时性和准确性。通过真菌培养，对脑脊液和血液标本进行隐球菌分离培养，进行规范的真菌药物敏感性试验，结合现有的隐球菌ECV出具药物敏感性报告，可以早期诊断并实施精准治疗。

目前，临床治疗隐球菌病的药物仅限于两性霉素B、唑类和5-氟胞嘧啶，长期使用抗真菌药物可引起隐球菌耐药，从而导致临床治疗失败。隐球菌感染治疗费用昂贵，治疗周期漫长[13]，因此迫切需要对其耐药性进行监测，对其耐药机制进行深入研究，对临床探索有效治疗方案具有重要意义[14]。有研究发现，新生隐球菌对伏立康唑和两性霉素B的耐药率为1.32%，对5-氟胞嘧啶的耐药率为0.33%[15]。在长期的抗真菌治疗过程中，隐球菌对抗真菌药物会产生耐药，从而导致治疗失败。因此，临床治疗需要实验室的体外药物敏感性试验报告作为合理用药的依据[16]。

本研究通过对该患者进行血清、脑脊液的隐球菌荚膜抗原检测，快速确诊为隐球菌感染，结合血培养和脑脊液培养分离出致病真菌，为临床确诊提供了重要证据。对于肺部影像学检查有结节，并且具有肺部或者脑部症状的患者，早期筛查隐球菌荚膜抗原具有重要意义。对分离的隐球菌进行质谱快速鉴定，可以准确鉴定到种。采用商品化真菌药敏试剂盒进行药物敏感性试验，结合隐球菌ECV发布药物敏感性报告，并进行适当的临床沟通和结果解释，有助于推动临床合理使用抗真菌药物，提高隐球菌感染的临床治愈率。