基于响应面法的玉米秸秆稀酸水解条件对菌株YA001产氢性能的影响

吕政颐， 孙根行， 安 丹， 谢林花

(陕西科技大学 环境科学与工程学院, 陕西 西安 710021)

0 引言

氢气作为一种清洁能源，被认为是缓解能源短缺和环境污染问题的理想燃料[1,2].目前，大部分氢气是由煤、石油、天然气等不可再生资源催化重整或水电解产生的，这些传统方法耗能大且对环境不友好.与其他制氢方法相比，利用可再生资源进行发酵制氢具有环境友好、在温和条件下能耗低等优点，是一种很有前途的制氢方法[3].

木质纤维素生物质因其丰富、廉价、可再生的特点，被用于氢气的生产，以实现资源的可持续发展.在生产过程中，首先将经过预处理的木质纤维素生物质通过机械法、物理法、化学法、生物法以及这些方法的综合运用[4-8]转化为单糖，再通过发酵生成H2.

纤维素生物质生物降解的主要困难是由于其高度有序的晶体结构被分子间氢键所稳定.过去几十年来，人们对不同木质纤维素生物质和预处理的水解进行了广泛研究.在所有预处理方法中，稀酸预处理被认为是制氢最有效的方法.玉米秸秆稀酸预处理工艺参数对制氢的影响研究较少.利用响应面法进行统计实验设计，可以有效地筛选关键因素，优化水解工艺参数[9-13].

因此，为优化玉米秸秆稀酸水解预处理水解参数，采用标准RSM设计，以水解物为碳源，进行暗发酵制氢试验.

1 实验部分

1.1 产氢细菌的筛选

该微生物从西安市郊区采集的奶牛粪便中分离得来.产氢菌株的富集、分离和培养所使用的基本培养基及菌株分离的方法[14]在前人的研究中已经提到.本研究分离出多个梭菌菌株，得到产氢量最高的菌株YA001.

1.2 材料

玉米秸秆从西安郊区收集，并研磨成60目左右的大小.收集固体颗粒，在80 ℃下干燥12小时后装入密封塑料袋，在4 ℃下保存.其性状如下：总固体含量(TS)96.51%，总挥发性固体含量(TVS)84.61%，灰分含量11.9%.

1.3 玉米秸秆水解

通过改变水解温度、反应时间、水解次数、盐酸浓度和固液比等参数优化水解参数.水解过程中，将水解液用布氏漏斗过滤，然后用蒸馏水洗涤固体残渣，直至洗涤水变成pH 7.0，再用固体残渣进行下一步稀酸水解.样品取自每一步的水解产物.收集所有水解产物进行分析和氢气发酵.

1.4 发酵制氢

所有实验均在330 mL反应器中进行.在反应器中，混合液250 mL包括接种量(5%)、2.5 g玉米秸秆的总水解物、10 mL KH2PO4-K2HPO4缓冲液(终浓度50 mM，pH值6.8)和20 mL营养液.将培养基的初始pH值调整为6.8.反应器最初用氮气冲洗以去除氧气，盖上橡胶塞子在中温(37±1℃)条件下，将反应器放置在转速为150 r/min的轨道摇床中.所有实验均独立进行3次，取平均数据作为实验结果.

1.5 分析方法

采用气相色谱仪(SP-3400)进行氢气浓度的测定.测试条件：后检测器温度：250 ℃；柱箱温度：90 ℃；载气：Ar.

氢气体积依据公式(1)计算[14]：

V=Vori+∑Viri

(1)

式(1)中：V-累计产氢量；Vo-反应器上部空间；Vi-反应器实时排出的液体体积；ri-实时氢气浓度.

采用3，5-二硝基水杨酸比色法(DNS)[15]测定可溶性糖的含量；采用重量分析法分别在105 ℃干燥箱和600 ℃马弗炉中测定TS和TVS的含量；玉米秸秆样品的结晶度指数(CrI)通过衍射仪 (PANalytical:X′pert PRD)在40 kV和40 mA铜辐射下测定；根据segal经验方法[16]计算CrI.用扫描电子显微镜(SEM)拍摄玉米秸秆的显微照片.

1.6 实验设计

1.6.1 Plackett-Burman设计

第一步优化的目的是在一阶多项式模型的基础上，利用Plackett-Burman设计筛选对制氢有显著影响的因素，这是一种筛选重要变量的有效技术[17].

Y=β0+∑βixi

(2)

式(2)中：Y为反应量即氢气产量(mL H2/g-TVS)；β0、βi和xi分别为模型截距、线性系数和自变量水平.

对酸浓度、反应时间、温度、水解次数和固液比等5个因素进行了研究.基于Plackett-Burman设计，对每个因子进行两个水平测试：低水平为-1，高水平为+1.表1显示了各因素的水平和显著性，表2列出了设计矩阵.通过12个实验考察5个因素.三次产氢量取平均值作为响应.选取95%水平(P<0.05)的因素作为产氢的重要因素并进行进一步研究.为了获得最优区域，沿路径进行了最速上升实验，如表3所示.

表1 Plackett-Burman设计的变量水平与统计分析

表2 Plackett-Burman实验设计矩阵

表3 实验设计及最速上升结果

1.6.2 Box-Behnken设计

在Box-Behnken设计的基础上，采用RSM对筛选的制氢变量进行优化.在统计计算中，编码值与实际值的关系描述为：

(3)

变量的水平和实验设计如表4所示.在本实验中共进行了15次试验，反应值为三次试验的平均值.

根据实验数据，进行回归分析.二次多项式方程拟合变量与响应之间的关系，以预测最佳条件，二阶多项式模型如式(4)所示：

(4)

式(4)中：Yi为预测响应;β0为常数;βi为衬垫系数;βii为平方系数，βij为交乘系数，xi、xj为独立变量.

分别使用软件Minitab 16.0版和origin 9.0对实验数据进行进一步的回归和图形分析.通过求解回归方程，同时分析响应面等值线图，得到所选变量的最优值[18].

2 结果与讨论

2.1 菌种的分离和鉴定

将去离子水浸泡过的奶牛粪便的细菌滤液富集在基础生长培养基中.在琼脂平板上培养后，选择44个菌株进行产氢试验.其中，菌株YA001的产氢性能最高，菌株YA001呈椭圆形，末端为圆形，宽度为1.0μm，长度为2.0～2.5μm[19].它们是双分裂、革兰氏阴性、孢子菌.该菌株可在厌氧条件下生长.

利用Blast程序将YA001菌株的16S rRNA序列(1471bp)与NCBI网站的公共基因库进行比对.菌株YA001的16S rRNA序列与ClostridiumbeijerinckiiNCIMB 8052有99%的同一性，因此将YA001菌株鉴定为Clostridiumbeijerinckii[19].

2.2 利用Plackett-Burman设计评价影响产氢的因素

采用placketer-burman设计方法研究了酸浓度、反应时间、反应温度、水解次数和固液比在制氢中的相对重要性.Plackett-Burman设计统计分析中的参数值列于表1.X1(酸浓度)、X2(温度)和X3(水解次数)对产氢量有显著性，将被纳入进一步优化实验.其他变量对产氢的显著性较低，所以在接下来的实验中均以低水平(-1)使用.

2.3 最速的上升路径

根据Plackett-Burman设计的结果，设计了最陡上升，增加X1(酸浓度)、X2(温度)和X3(水解次数)，以提高反应速度，接近最值区域.在酸浓度0.6%，反应温度130 ℃，水解次数3的条件下，达到了最佳区域，最高响应为146.09 mL H2/g-TVS，表明该步已接近优化区域，选择进一步优化以获得最高响应.

2.4 优化稀酸水解制氢的关键因素

2.4.1 回归分析及方差分析

通过RSM的Box-Behnken设计，研究了关键因素(酸浓度、温度和水解次数)的最佳水平及其相互作用对产氢的影响.实验设计、各变量的实际水平及所进行的各项实验结果如表4所示.

表4 三个独立变量的Box-Behnken设计

产氢量的Box-Behnken设计的回归分析和方差分析分别如表5和表6所示.

表5 Box-Behnken设计回归分析结果

表6 回归模型方差分析结果

通过对实验数据进行多元回归分析，得到二阶多项式方程数学模型，如式(5)所示：

(5)

式(5)中：Y为预测产氢量(mL H2/g-TVS)；X1、X2和X3分别为酸浓度、温度和水解次数的编码值.

采用方差分析(ANOVA)检验二次方程模型拟合的充分性和显著性，方差分析的总结如表6所示.这里的R2值，即测定系数，是衡量模型拟合度好坏的指标，接近1.0表明二次方程模型与实验数据表现出非常好的拟合度.在该模型中，R2为98.46%、95.68%，这表明该模型在本研究中对氢气生产非常可靠.

2.4.2 关键因素对产氢量的影响

(1)酸浓度对产氢量的影响

酸浓度是酸水解过程中糖类释放和降解的关键参数，对产氢量也起着重要作用，如图1(a)～(d)所示，在温度或水解次数不变的情况下，随着酸浓度的逐渐升高产氢量越高.产氢量随酸浓度的增加而升高，是因为酸浓度的增加使氢离子数量增加，边界层电荷扰动增加，促进了还原糖的释放[21].

产氢量随酸浓度的增加而升高，是因为在抑制浓度下，产氢量与还原糖含量的增加呈正相关.产氢量随酸浓度的进一步增加而降低，超过其最佳点，如图1(a)～(d)所示，这是由于在含高浓度酸的预处理条件下，还原糖降解为糠醛、5-HMF或其他副产物所致[22].

(a)温度和酸浓度对产氢量影响的响应面图

(b)温度和酸浓度的等高线图

(c)水解次数和酸浓度对产氢量影响的响应面图

(d)水解次数和酸浓度的等高线图

(f)水解次数和温度的等高线图图1 产氢量的响应面图和相应的等高线图

(2)水解次数对产氢量的影响

水解次数对糖的释放有很大的影响，从而对产氢量产生较大影响.如图1(e)、(f)所示，随着水解次数的增加，产氢量迅速增加.在水解次数为3次时，产氢量达到最大值，之后随着水解次数的进一步增加，产氢量降低.由表7所示，随着水解次数的增加，还原糖产率和水解率迅速下降，而且随着水解次数的增加，糠醛、5-HMF和乙酸不断积累[23]，导致产氢率下降.当水解次数超过3次时，还原糖的产量不会大幅度提高，而且积累了更多对制氢有害的副产物.因此水解次数不应超过3次.

(3)温度对产氢量的影响

温度是影响产氢量的重要因素，如图1(a)、(b)、(e)、(f)所示，在达到最高点之前，在酸水解浓度的条件下，产氢量会随着温度的升高而变高，这是由于玉米秸秆的结构受到温度的破坏.在常温下，多糖以稳定的结晶形式(环状)存在.在较高温度下，多糖中的大部分单糖以开链形式存在.随着温度的升高，分子获得了更高的动能，氢离子与玉米秸秆之间的碰撞速率加大，氢离子随机攻击糖苷键，超过了活化能屏障，导致水解降解反应的发生[21].随着温度的进一步升高，产氢量逐渐下降.对于该现象，Bustos等[24]和Lee等[25]认为，酸用于水解，需要相对较高的预处理温度，在较高的预处理温度下产生糠醛、5-HMF等有机酸抑制性产物，抑制了后期氢气的产生.

2.4.3 各因素之间的相互作用对产氢量的影响

图 1(b)、(d)、(f) 所示的椭圆等高线图表明变量间的相互作用是显著的.相反，图1(f)所示为圆形等高线图，这表明温度和水解次数之间的相互作用是轻微的相互依赖，它们的相互作用对制氢的影响可以忽略不计.如图1(a)、(b)所示，温度的变化对产氢量的影响比酸浓度的变化大.如图1(c)、(d)所示，水解次数的变化对产氢量的影响比较显著，而酸浓度的变化不重要.此外，如图1(e)、(f)所示，与温度的变化相比，水解次数的变化不太显著.总体来说，三个变量对产氢量的重要性为：温度>水解次数>酸浓度.本研究表明，温度对稀酸水解玉米秸秆水解液产氢起着重要作用.

2.5 模型的验证

根据统计设计的实验结果，优化后的玉米秸秆稀酸水解参数为：盐酸浓度0.61%，温度129.85 ℃，水解次数3次，反应时间30 min，固液比1∶10.在上述优化条件下，得到产氢量为149.52 mL H2/g-TVS，远高于未进行预处理时的0.78 mL/g-TVS.

2.6 玉米秸秆的生物降解机制

2.6.1 玉米秸秆的X-射线衍射(XRD)分析

纤维素生物质的结晶度经常被作为评价生物质水解和生物利用的一个因素.测定了原玉米秸秆(RC)、水解1～4次(ACO、ACT、ACS和ACF) 以及制氢后的玉米秆残渣样品(ACH)等的X射线衍射图谱，其结果如图2所示.CrI由XRD测试数据确定和估算.ACO、ACT、ACS、ACF、ACH和RC的降解率(DR)、CrI和可溶性糖产率(SSY)如表7所示.

图2 RC、ACO、ACS、ACT、ACF和ACH的X射线衍射图谱

表7 ACO、ACT、ACS、ACF、ACH和RC的DR、CrI和SSY

由于去除了半纤维素，CrI、DR和SSY分别由35.55%、0%和0 mg/g tvs提高到50.91%、39.37%和416.67 mg/g tvs.ACO、ACT、ACS和ACF样品的DR和SSY随水解次数的增加而逐渐降低，得出水解次数不应超过三次的结论.ACT的CrI从ACO的50.91%降至47.24%，表明可以降解纤维素，但纤维素的降解率很低.ACS和ACF的CrI、DR和SSY变化不大，说明半纤维素完全降解，纤维素降解缓慢.

产氢后，ACH的DR和CrI分别下降到3.9%和48.2%，说明产氢菌进一步破坏了玉米秸秆的 结晶.但与ACF相比，ACH的DR和CrI变化不大，说明稀酸水解对玉米秸秆产氢的影响较大.

2.6.2 玉米秸秆在降解过程中的形态变化分析

常用SEM来观察和研究纤维素生物质的表面特征和形态特征.图3显示了玉米秸秆水解过程中各步骤的形态变化和制氢后玉米秆的形态.未被破坏的玉米秆表面光滑、连续(如图3(a)所示).玉米秆表面越来越松散，逐渐被破坏，说明随着水解次数的增加，木质素、纤维素被破坏，半纤维素溶解(如图3(b)～(e)所示).稀酸水解样品的固体秸秆样品经氢气发酵降解成蜂窝状微孔，表明产氢微生物对玉米秸秆残渣的形态(如图3(f)所示)破坏明显.图3片证明玉米秸秆的形态变化不仅来自于酸水解，也来自于微生物降解.

(a)RC (b)ACO

(c)ACT (d)ACS

(e)ACF (f)ACH图3 玉米秸秆样品的扫描电子显微照片

2.7 生物制氢的产量

表8总结了一些文献中关于纤维素原料水解用酸催化剂进行生物制氢的研究.本研究中获得最高产氢量为149.52 mL H2/g-TVS；257.04 mL H2/g R-sugar，与已有研究相比处于中上水平.

表8 利用纤维素水解物发酵制氢产量的比较

3 结论

响应面设计是优化玉米秸秆水解关键工艺参数的一种有效方法，可以最大限度地提高玉米秸秆的制氢效率.实验结果表明，在酸浓度为HCL 0.61%、温度129.85 ℃、水解时间30 min、水解次数为3、固液比1∶10的条件下，还原糖产率为581.7 mg/g-TVS，最大产氢量为149.52 mL/g-TVS.

利用扫描电镜对玉米秸秆水解制氢前后的微生物特性和表面结构进行了进一步研究.结果表明，稀酸水解对玉米秸秆的制氢还原糖具有重要作用，玉米秸秆的降解不仅是水解反应，而且是生物降解反应.