五粮液原酒中特殊芳香族化合物的空间分布

杨康卓，刘 芳，何张兰，张建敏，乔宗伟，彭志云，郑 佳，赵 东

（宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾 644007）

芳香族化合物是一类具有苯环结构的化合物，白酒中常见的芳香族化合物有苯酚、对甲酚、苯乙醇、苯甲醇、苯乙醛、苯甲醛、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯等等，对白酒酒体贡献马厩味、烟熏味、丁香味、花香味等等，是白酒中主要呈香物质的同时也是异嗅类物质。因而研究芳香族化合物在白酒中的量比关系对提高白酒质量无疑具有重要的意义。

芳香族化合物广泛存在于浓香型白酒酿造过程中的各个环节。在不同酒精度的五粮液中，通过气相色谱嗅闻（GC-O）技术检测到了11种芳香族化合物，其中苯乙酸乙酯等化合物被认为是造成高度和低度五粮液风味特征区别的原因[1]；包包曲中共有22种芳香族化合物被检测到[2]，其中苯乙醇、愈创木酚被认为是优质浓香型大曲的主要香味成分，而苯甲醛、苯甲醇为优质浓香型大曲香味体系的组成部分[3]；在窖泥与糟醅中也检出了12种芳香族化合物，其中对甲酚可能是由窖泥产出的形成区别于糟醅香气特征的原因之一[4]。由此可见，芳香族化合物是浓香型白酒中一种很重要的呈香物质，掌握它们在原酒中的具体含量是很有必要的。

五粮液是多粮浓香型白酒的典型代表，其具有“香气悠久、味醇厚、入口甘绵、入喉净爽、诸味协调、恰至好处、尤以味全面而著称”的独特酒体风格。这种风格与五粮液特有的“分层起糟、分层蒸馏，按质并坛”工艺有着必然联系。其中“分层起糟、分层蒸馏”的原因是不同空间层次的糟醅所接触的条件不同，形成了质量差异，其蒸出的酒也是品质各异。据研究表明，浓香型白酒中不同空间层次的原酒从感官和呈香物质的含量上均有明显差异[5]。而“按质并坛”就是为了将这些不同层次、品质各异的原酒区别开来，按质组合，为后期的勾调工艺打好基础[6-7]。因此，掌握不同层次原酒中风味物质的准确信息对“按质并坛”具有非常重要的指导意义。

目前国内的浓香型原酒研究中，少有对芳香族化合物进行定量的报道，而且对它们在不同层次原酒中的空间分布规律了解得也不够全面。因此，本研究对9种生产过程中出现的具有特殊香气贡献的芳香族化合物进行了定量研究，分析了它们的空间分布规律，为浓香型原酒的层次判定提供基础数据，同时也为“按质并坛”工艺提供了新的理论支持。

1 材料与方法

1.1 样品采集

实验原酒均采集自五粮液股份有限公司酿酒车间随机选取11口窖池；所选窖池均为40年以上窖龄。

空间层次分布：空间层次分为上层、中层和下层；其中上层为距地面10～20 cm处，中层为黄水线上20～30 cm处，下层为黄水线下30 cm处。

原酒采集方法：不同空间层次的原酒均采集于对应空间层次的糟醅。糟醅经蒸馏后去掉酒头，摘取的一级酒为实验分析原酒。

所有实验原酒酒精度均在65%vol～70%vol。

1.2 仪器与药品

气相色谱-质谱联用仪（带有自动前处理平台的GC/MS）PAL RTC2-7890B/5977B，美国Agilent公司；离心机，德国Eppendorf；涡旋仪Vortex-Genie 2，美国Scientific Industries公司。

无水乙醇（色谱纯），美国Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷（CH2Cl2，ACS级），上海百灵威有限公司。无水硫酸钠、氯化钠（ACS级），阿拉丁试剂有限公司；4-辛醇，GC标准品，美国Sigma-Aldrich公司；苯甲醛、苯乙醛、苯乙酸乙酯、愈创木酚、苯甲醇、苯丙酸乙酯、苯乙醇、苯酚、对甲酚等，GC标准品，日本TCI公司。

1.3 液液微萃取（LLME）

将10 mL酒样和20 mL饱和食盐水加入50 mL离心管中,再加入内标物50 μL(4-辛醇，100 mg/L)，用1 mL重蒸的二氯甲烷进行萃取，振荡混匀1 min，经3000 r/min离心3 min后分层，取1 μL下层的萃取剂进入GC-MS进行分析。

1.4 GC-MS分析

气相色谱条件：载气为He(99.999 %)，流速1 mL/min；色谱柱为HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度为230 ℃；不分流进样；柱箱升温程序为40 ℃保持5 min，然后以4 ℃/min升至230 ℃并保持5 min。

质谱条件：EI电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，接口温度250 ℃，扫描范围35.00～350.00 amu。

1.5 定性

通过与NIST14a.L(Agilent Technologies Inc.)中标准质谱图对比并与标准样品的质谱图、保留时间及文献报道的保留指数比对定性指定的所有芳香族化合物。

1.6 定量

采用内标法(以4-辛醇为内标)绘制标准曲线对芳香族化合物进行定量分析。具体操作步骤是用60%vol乙醇水溶液将需定量的芳香族化合物标准品配制为高浓度的混合标准溶液，再稀释配制成不同浓度梯度的混合标准溶液。分别取10 mL混合标准溶液按照上述液液微萃取的方法萃取后，用气相色谱-质谱联用仪检测，用特征离子(SIM)对待测化合物进行积分，以需定量的芳香族化合物的标准品与内标物的特征离子峰的峰面积之比为横坐标，检出的芳香族化合物的标准品与内标物的浓度之比为纵坐标绘制标准曲线。

检出限（LOD）：以信噪比为3时，所检测出的物质浓度作为该物质的检出限。

定量限（LOQ)：以信噪比为10时，所检测出的物质浓度作为该物质的定量限。

相对标准偏差（RSD）：以3次独立实验测定的数据来计算RSD。

回收率：在已知目标化合物的浓度酒样中，添加一定量的对应标准品，平行测定3次，通过以下公式（加标回收率=(加标试样测定值-试样测定值)÷加标量×100%）计算回收率。

重现性：以同一天连续测定15次的化合物保留时间的RSD作为日内重现性；以连续5 d相同时间段测定的化合物保留时间的RSD作为日间重现性。

1.7 香气活度值（OAV）

香气活度值是指测定的化合物浓度与该化合物的香气阈值浓度之比，以此来表示该化合物对香气的贡献度。

2 结果与讨论

2.1 芳香族化合物定量方法的评估

2.1.1 标准曲线及相关参数

本研究中芳香族化合物标准曲线的线性相关系数R2均大于0.9971（苯乙酸乙酯），线性良好；所测酒样中芳香族化合物的含量均在标准曲线的线性范围内；方法的检测限为0.23～3.67 μg/L，定量限为0.77～12.23 μg/L，均较低（表1）。

表1 芳香类物质的定量标准曲线、线性范围、检出限和定量限

2.1.2 精密度、回收率及重现性

采用相对标准偏差作为定量方法的精密度（表2），经测定9种芳香族化合物的RSD均小于2 %，加标回收率在102.18 %～122.41 %。而各化合物的日间重现性与日内重现性均小于1%。综上所述，该方法能满足五粮液原酒中9种芳香族化合物的定量分析需求。

表2 芳香族化合物定量的精密度、回收率和重现性

2.2 原酒中9种芳香族化合物含量空间分布和OAV分析（图1、表3）

图1 原酒中9种芳香族化合物的含量空间分布

表3 9种芳香族化合物在原酒中的OVA值

由图1可知，原酒中9种芳香族化合物的浓度各不相同，它们的高低顺序分别为苯乙酸乙酯＞苯甲醛＞苯乙醛＞苯乙醇＞对甲酚＞苯丙酸乙酯＞苯甲醇＞愈创木酚。

通过计算各物质的OAV值，发现苯乙酸乙酯、对甲酚、苯甲醛、苯丙酸乙酯、愈创木酚等5种化合物在五粮液原酒中OAV值均大于1，说明它们对原酒的香气具有贡献。苯酚、苯乙醇、苯甲醇等3种化合物的OAV值均小于1，说明这3种物质对原酒香气的贡献度可能很低。然而在以往研究中，苯酚被认为是五粮液酒中一个重要的风味物质[6-7]。因此，它对香气的贡献还需进一步深入研究。

2.3 9种芳香族化合物的空间分布规律（图2）

由图2可知，9种芳香族化合物中愈创木酚、苯甲醛、苯乙醇、苯甲醇等4种化合物在不同空间层次的原酒中未有明显差异。通过将其余5种化合物进行不同层次间的差异化分析，我们发现：对甲酚，学名为4-甲基苯酚，被认为与窖泥臭有十分密切的关系[11]。从空间分布规律来看，其表现为下层＞中层＞上层，含量随着窖池空间深度的增加而增加。这是因为4-甲基苯酚主要是窖泥中的厌氧微生物产生，下层空间中随着深度的增加厌氧环境变好，窖泥中对甲酚的含量便随之增加[12]；由于窖泥与糟醅香气物质的交换效果，对甲酚不同层次间糟醅含量也存在了明显差异[12]；在五粮液“分层起糟、分层蒸馏”的特有工艺前提下，形成了不同空间层次的五粮液原酒中对甲酚的分布规律。

图2 不同空间层次原酒种4种芳香族化合物的差异化分析

苯乙酸乙酯、苯酚的含量在下层原酒中明显高于中层和上层，但在中层和上层间区别并不明显。而苯乙醛正好相反，其含量在上层原酒中明显高于中层和下层，在中层和下层间区别不明显。

3 结论

本研究基通过LLME-GC/MS的方法进行了定量分析。该方法具有线性好，检出限低，精度高，重现性好的特点，完全能满足五粮液原酒中9种芳香族化合物的定量需求。通过定量，五粮液原酒中芳香族化合物的排列规律为苯乙酸乙酯＞苯甲醛＞苯乙醛＞苯乙醇＞对甲酚＞苯丙酸乙酯＞愈创木酚＞苯甲醇。其中苯乙酸乙酯、对甲酚、苯甲醛、苯丙酸乙酯、愈创木酚是较为重要的呈香物质，对甲酚随窖池深度增加而升高的现象明显。因此，可把对甲酚作为一种除传统醇酯指标外，判定五粮液原酒层次的一种潜在的特征指标。