氢氧化钾湿片法与荧光染色法在浅部真菌检查中的使用

文/张文革

随着我国经济社会的快速发展和综合国力的显著增强，城乡居民生活水平显著提高，人们对皮肤病的认识和重视程度也显著提高。据我院皮肤科门诊量统计，2012年到2019年逐年递增，最高年门诊量达16万余人次。其中较为常见真菌感染患者人次也屡见不鲜，其中我实验室统计的真菌镜检检测数量，由2012年的1785人次递增到2019年的8395人次得出，这是显而易见的。通常，夏季较为明显。炎热多汗为真菌生长创造有利条件，可能会加重手、足、股癣的皮损，给患者带来强烈不适。 真菌检测在皮肤科临床检查中，应用极为广泛，通过检测诊断真菌感染，是临床必不可少的一部分。目前真菌检查还主要依赖于技术员人工操作，没有太多的机器操作。10%氢氧化钾湿片法是经典的真菌检查方法，在早期皮肤科发展中，也起到很重要的诊断作用。然而，随着时代进步，科技不断发展，科研不断创新，我们的检测方法也在改良。荧光染色法无论从显微镜下还是从检测报告中都能让人们更好、更清楚地看到真菌。我院皮肤科从2016年引进真菌荧光染色法，临床诊断改变是有目共睹的[1-3]。

1 资料与方法

资料：2016年7月13日到8月27日的1005例门诊真菌检测的病例，其中足癣228例、手癣106例、股癣101例、甲癣224例、体癣203例、鼻毛囊虫36例，阳性例数为106、19、55、79、88、23。2019年7月21日到8月20日的1002例门诊真菌检测病例，其中足癣110例、手癣48例、股癣81例、甲癣236例、体癣46例、鼻毛囊虫59例，阳性例数为54、13、59、117、22、41。

氢氧化钾湿片法：酒精消毒患者皮损部位（黏膜部位除外）取材刀刮取患者患处皮屑或甲屑，取材量为肉眼可见的多，尽量多取材，放在滴好10%氢氧化钾的载玻片上，混为悬液，盖上盖玻片，在酒精灯上微微过一下（加速角质溶解），即可在显微镜下观察（莱卡 自然光源显微镜）。结果解释:看到有折光性，粗细较为均匀，呈现丝状形态，在细胞上或细胞之间的结构， 即可报真菌镜检阳性。

荧光染色法：酒精消毒患处，用取材刀刮取皮屑或甲屑，在载玻片上滴一滴荧光试剂A液，将取好的皮屑放在载玻片上，与A液混匀后滴加B液，盖上盖玻片，用棉签吸取多余液体，即可在荧光显微镜上观察。检验结果解释：样本进行染色后，荧光显微镜下观察，先用低倍镜找到可疑真菌菌丝所在位置，调至视野正中央，在用高倍镜观察真菌菌丝或孢子结构加以确定，电脑裁图，签发报告。

2 结果

传统的氢氧化钾湿片法，在镜下可看到都是透明的，顾名思义我们也称之为透明法，视野也不是很清晰，很难区分上皮细胞边缘和真菌菌丝，不能快速识别真菌。荧光染色法则不同，荧光镜下，上皮细胞和真菌菌丝都很漂亮，视觉更舒适，菌丝更为明显，就算隐藏在上皮细胞缝隙里，也清晰可见荧光蓝色的真菌菌丝，不仅临床诊断快，也更有利于教学。

足癣、手癣、股癣、甲癣、体癣、鼻（毛囊虫）荧光染色法和氢氧化钾法的阳性率分别是49%、27%、72%、49%、47%、69%和46%、18%、54%、35%、43%、64%，荧光染色法明显更优于氢氧化钾法

3 讨论

真菌病在皮肤科门诊中非常常见，在当下快节奏的生活中，它严重影响了人们的生活质量。因此，更依赖于我们真菌的诊断。真菌病诊断方法有很多，临床更多见于真菌镜检和培养。真菌培养最为可靠，但是它耗时长，需要经验丰富的技术员来鉴别，并不太适合临床常规的快速诊断。所以真菌镜检才是诊断真菌病的最基础最实用的方法。氢氧化钾法是最早的真菌检测方法，快速，简便，成本低是它的特点但是对于临床技术员要求高，需要很长一段时间的学习，才能独当一面。阳性率的影响因素也很多，取材量要肉眼可见的多，取材部位要明确，取材方法，患者配合度。对于这项工作需要长时间的耐心与磨炼才能稳扎稳打的进行。这对于临床需要是不可取的，假阴性的结果影响临床医师的判断，对诊断真菌病受到巨大阻碍。

荧光染色法原理是荧光染料能与真菌细胞壁的纤维素、几丁质和其他β-多糖无特异性结合，从而标记荧光，在荧光显微镜下进行区分和检测。随着荧光染色法的问世，真菌诊断有了质的飞跃。这引起了大家的共鸣，事实证明的确如此，见表1。

表1 真菌荧光染色图片

本研究表明，荧光染色法在临床实际应用中有明显的优势，虽然有些阳性率差距不是很大，如手癣阳性率仅差2%，这可能与门诊检验技师均为两年以上，工作经验丰富，取材方法准确有关。从日常临床工作材料中的数据总结来说，不存在主观偏差。目前荧光染色法在各大医院皮肤科广泛应用，在真菌检测报告中，清晰可见的亮蓝色菌丝，是临床医师进行诊断的有力证据，是给患者的最完美的解释。见图1，图2，图3。

图1 为荧光染色法镜下真菌形态

图2 为荧光染色法镜下毛囊虫形态

图3 为10%氢氧化钾法镜下真菌菌丝形态