补肾活血固齿方对MC3T3-E1细胞PDGF表达的影响

王彦敏 刁志虹 杨梦华 都广艳 高 毅

牙周炎是口腔科常见病、多发病，与全身多种系统性疾病密切相关。牙周炎是以牙槽骨进行性吸收破坏、牙齿松动为主要表现的疾病，牙周组织的恢复和重建是治疗牙周炎的关键。牙周组织重建被定义为在组织学上有明显的新生牙槽骨、牙周膜细胞等再附着于已丧失牙周组织的牙根表面。研究表明细胞因子在成骨细胞的增殖和分化过程中有重要的调节促进作用，血小板生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）因其在组织再生过程中发挥着积极的作用而受到广泛的关注。笔者将补肾活血固齿方含药血清作用于小鼠颅顶前成骨细胞（MC3T3-E1细胞），通过观察该方剂对MC3T3-E1细胞PDGF表达的影响，对补肾活血固齿方治疗牙周炎的作用机制进行初步探讨。

资料和方法

1.主要试剂：小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14（MC3T3-E1细胞）购自中国科学院上海细胞库ATCC CRL-2594，α-MEM培养基（美国GIBCO公司），胰蛋白酶（Sigma），乙二胺四乙酸二钠（EDTA）（北京索莱宝科技有限公司）胎牛血清（PAA Laboraties GmbH），叶酸（Amresco），戊巴比妥（华北制药有限公司股份）。小鼠血小板（PDGF）ELISA检测试剂（北京江莱生物有限公司）。

2.实验动物：清洁级健康雄性SD系大鼠，280～300克20只，由河北医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：冀医动管字号SCXK（冀）2008-1-003。饲养条件：室温保持在18℃～25℃，空气流通，12h维持光照，动物在笼中自由摄食饮水。饲料由河北医科大学实验动物中心提供。

3.MC3T3-E1细胞的培养：将购置的MC3T3-E1细胞，吸去原培养液，PBS溶液清洗2遍，加入0.25%胰酶1ml，37℃消化1min，加α-MEM培养基1.5ml终止消化，反复吹打细胞，使其悬浮，移至15mL离心管，1000rpm离心5min，吸去上清液，加入培养基4.5ml，轻轻吹打，使管底细胞悬浮，均匀分散。取3个培养瓶，向每个培养瓶中滴入细胞悬液1.5ml，3个培养瓶置于37℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后，每3d换液1次。培养5至6天，细胞铺满瓶底70～80%时处于对数生长期，用于下一步实验。

4.中药成分及药剂制备：药物组成：淫羊藿15g、补骨脂15g、熟地黄10g、当归10g、丹参10g、知母10g、甘草3g。药剂制备：药物加10倍量蒸馏水煎煮1.5h，过滤；加同量蒸馏水重煎1.5h，过滤，合并滤液浓缩至150ml，装袋备用。

5.实验分组：实验分为3组：含药血清组（A组）、无药血清组（B组）、胎牛血清组（C组）。将20只280～300克SD大鼠随机分为A组和B组，每组各10只。按4.875g生药/kg体重计算用药量。A组大鼠每天灌胃药物2次，连续灌胃7d，最后1d第2次灌胃后间隔2h再次灌胃，末次灌胃1h后，1.2%戊巴比妥麻醉大鼠，经腹主动脉采血，每只大鼠的血液置于不同离心管中，冷置1h后，3000rpm离心20min，将各只大鼠离心管中的上清液置于同一离心管中混合以减少不同大鼠的个体差异，56℃灭活30min，滤菌器抽滤除菌后分装，-20℃保存备用。B组大鼠用等剂量生理盐水灌胃，灌胃及血清制备方法同上。C组的血清购买于PAA Laboraties GmbH。

6.用双抗体夹心法（ELISA法）测定细胞培养上清液小鼠PDGF水平：将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞经0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，取3块48孔板，将3组细胞分别接种于48孔板，每孔细胞15000个，37℃，5% CO2培养箱中培养2天。培养2天后，3块板均换用10%含药血清，无药血清，胎牛血清培基培养细胞，每块板每组血清均设8个复孔。于培养24min，48min，72min各拿出一块48孔板，收集所有孔内培养液，5000rpm低温离心30min，吸取上清液，-20℃保存备用。严格按小鼠血小板生长因子（PDGF）试剂盒使用说明书上的操作步骤进行检测，30min内用酶联免疫检测仪在450nm波长下测每孔OD值。

6.统计学方法：采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

含药血清组（A组）培养上清液光密度值（OD值）明显高于无药血清组（B组）和胎牛血清组（C组）（表1），统计结果显示差异有显著性（P＜0.05）;无药血清组（B组）和胎牛血清组（C组）相比，OD值无显著性差异（P＞0.05）。提示补肾活血固齿方能促进MC3T3-E1细胞分泌PDGF，参与促进牙周膜细胞的增殖、分化，诱导新骨的形成，促进牙槽骨的再生。

表1 ELISA法检测各组细胞上清液中血小板生长因子的表达（n＝8，mean±s）

讨 论

牙周炎相当于祖国医学的“牙宣”、“齿衄”范畴。祖国医学运用中药，尤其是补肾方治疗牙齿松动有着悠久历史，临床已证实补肾中药治疗牙周炎均取得了较好的临床疗效[1～3]。中医辨证论治，注重对全身因素的调节，弥补了西医主要针对细菌因素治疗牙周炎的局限性[4]。笔者多年来应用补肾活血固齿方治疗牙周炎取得了良好的临床疗效，但其作用机理不明确[5～10]。

牙周炎是以牙槽骨进行性吸收破坏、牙齿松动为主要表现的疾病，牙周组织的恢复和重建是治疗牙周炎的关键。牙周组织重建被定义为在组织学上有明显的新生牙槽骨、牙周膜细胞等再附着于已丧失牙周组织的牙根表面。近年来研究表明细胞因子对成骨细胞的增殖和分化具有重要的调节促进作用，在众多细胞因子当中，血小板生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）因其在组织再生过程中发挥着积极的作用而受到广泛的关注。PDGF是一种激素类生长因子，主要存在于血小板的颗粒中。1997年Whitman等将血小板生长因子应用于局部口腔术后组织的修复，自此越来越多的学者关注于此方面的研究，并相继验证了血小板生长因子具有促进细胞增殖和组织修复的作用[11，12]。齐静等[13]将主要成分为PDGF的富血小板血浆作用于体外培养的人牙周膜细胞，发现PDGF能促进牙周膜细胞增殖和ALP的活性。施六霞等[14]的研究也得到了相同的结论。大量的研究还发现，PDGF对成骨前体细胞、成骨细胞等都具有趋化作用，是趋化作用最强的骨生长因子之一，它可以促进骨的再生与修复，并且对骨前体细胞的增殖作用存在量效关系[15，16]。

补肾活血固齿方剂是以中医传统理论“肾主骨”为原则，治疗肾精亏损型牙周炎的方剂。其组成：淫羊藿、补骨脂、熟地黄、当归、丹参、知母、甘草。当归、熟地黄、丹参以补血活血、滋补肾阴、生精补髓为君药；淫羊藿、补骨脂以补肾、壮骨、强筋为臣药；知母以滋肾泻火，清热除烦为佐药；甘草以清热解毒、调和诸药为使药。淫羊藿和补骨脂是传统中医常用的两味补肾壮骨饮片，淫羊藿的主要有效成分是淫羊藿苷，有促进成骨细胞增殖分化，抑制破骨细胞的分化的功能[17，18]；当归、熟地黄、丹参具有调节免疫功能，抵抗炎症的作用[19～21]。知母能减少IL-1β、TNF等促炎介质的产生，对骨质流失起到一定的抑制作用[22]。

本研究发现，用补肾活血固齿方含药血清培养小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1，细胞上清液中PDGF的检出量明显增加，提示该方剂可促进成骨细胞分泌PDGF，促进牙周膜细胞的增殖分化，诱导新骨的形成，促进牙槽骨的再生，这为补肾活血固齿方治疗牙周炎提供了可能的理论基础之一。