同位素稀释—气质法测定白酒中氨基甲酸乙酯的测量不确定度评定

王开宇 于欣欣 都 芸 马燕玲 吴 帅

(烟台市食品药品检验检测中心,山东 烟台 264000)

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)是食品在发酵和贮藏过程中天然产生的污染物，是一种多位点致癌物，可能会导致啮齿类动物皮肤癌、肝癌等疾病的发生[1]。2007年，世界卫生组织正式将EC归为2A类致癌物(可能令人类患癌的物质)[2]。酒精饮料在生产中会产生EC，尿素、氢氰酸等物质会与乙醇相互作用生成EC[3]，因此EC污染已成为近年来被高度关注的酒类食品安全热点问题之一，已有多个国家和国际组织对其限量进行了规定，日本清酒为100 μg/L，法国、德国和瑞士水果白兰地分别为1 000，800，1 000 μg/L，美国佐餐葡萄酒为15 μg/L，甜葡萄酒为60 μg/L[4]。目前中国尚未制订食品中EC的限量标准，但其风险控制应该得到高度重视[5]。例如，姚晓洁等[6]对河南省1 882批白酒中EC含量进行检测时发现，52.3%的白酒样品中检出了EC，其中最高含量为1 680 μg/kg，平均值为49.9 μg/kg。

目前，国内外对EC含量的测定主要有气相色谱—质谱(GC-MS)、高效液相色谱—质谱(HPLC-MS)、高效液相色谱—荧光检测(HPLC-FLD)等方法[7]，中国也发布了检测标准GB 5009.223—2014《食品安全国家标准 食品中氨基甲酸乙酯的测定》，采用内位素稀释，碱性硅藻土固相萃取，GC-MS检测，其测量不确定度也有报道。但是，包括其他采用内标—标准曲线法的测量不确定度评定普遍存在一些问题，主要是混淆了测量模型与不确定度因素之间的关系，将测量模型中样品定容体积作为不确定度分量进行评定；此外，测量结果与内标液浓度有关，与测量结果有关的不确定度因素未能进行正确分析。

试验拟依据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》，以食品安全检测标准GB 5009.223—2014为例，评定同位素稀释—标准曲线法的测量不确定度，旨在为分析出影响氨基甲酸乙酯测量结果的主要因素并加以控制，规范内标—标准曲线法的测量不确定度评定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氨基甲酸乙酯标准品：美国AccuStandard公司；

D5-氨基甲酸乙酯(D5-EC)：美国AccuStandard公司；

甲醇、正已烷：色谱纯，德国MERCK公司；

乙酸乙酯、乙醚：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

气相色谱—质谱联用仪：7890B-5977B型，美国安捷伦公司；

电子天平：SQP型，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；

碱性硅藻土固相萃取柱：Cleanert EC氨基甲酸乙酯专用固相萃取柱，天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.3 试验方法

依据GB 5009.223—2014《食品安全国家标准 食品中氨基甲酸乙酯的测定》。试样中加入D5-氨基甲酸乙酯同位素内标后，经碱性硅藻土固相萃取柱净化、洗脱，浓缩定容，用气相色谱—质谱仪进行测定，标准曲线内标法定量。

1.3.1 标准溶液配制

(2) 氨基甲酸乙酯标准溶液：准确称取0.100 0 g氨基甲酸乙酯标准品于100 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，得质量浓度为1.00 mg/mL的EC储备液；再用甲醇逐级稀释至10.000，0.500 μg/mL的EC中间液。

(3) 混合标准溶液系列：准确吸取0.500 μg/mL的EC中间液20，50，100，200，400 μL和10.0 μg/mL的EC中间液50，100 μL于7个气相用进样瓶中；准确吸取100 μL 2.00 μg/mL的D5-EC使用液添加至各瓶中，用甲醇补加至1 mL，涡旋混匀，得到质量浓度分别为10.0，25.0，50.0，100.0，200.0，500.0，1 000.0 ng/mL，含内标cD5=200 ng/mL的混合标准溶液。另配制一瓶含内标为200 ng/mL 的空白溶液。

1.3.2 样品处理 精确称取2.000 g样品，准确加入2.00 μg/mL 的内标D5-EC使用液100 μL，40 ℃氮吹至约0.5 mL后补加水至2 mL，加氯化钠0.3 g，混匀后加至碱性硅藻土固相萃取柱上，静置10 min。用10 mL正已烷淋洗后，用10 mL 5%乙酸乙酯—乙醚溶液以约1 mL/min 流速进行洗脱，洗脱液经装有2 g无水硫酸钠漏斗脱水后，氮吹至约0.5 mL，用甲醇加至约1 mL，混匀，待气质分析。

1.3.3 气质条件

(1) 气相条件：毛细管色谱柱VF-WAXms，30 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度220 ℃；柱温为初温50 ℃ 保持1 min，以5 ℃/min升至180 ℃，240 ℃后运行5 min；载气为氦气，1 mL/min；不分流进样，进样量1 μL。

(2) 质谱条件：电子轰击源(EI)，温度230 ℃，70 eV；选择离子监测模式(SIM)；选择离子：氨基甲酸乙酯m/z44，62，74，89，定量离子62；D5-氨基甲酸乙酯m/z64，76，定量离子64。

1.3.4 进样分析 内标空白溶液进样1次，内标空白溶液中不含目标物氨基甲酸乙酯，不干扰样品检测。标准溶液每浓度进样2次，计算EC与D5-EC峰面积之比，以峰面积之比为纵坐标，EC浓度为横坐标，绘制标准曲线。样品每平行样进样2次，以峰面积之比平均值从标准曲线计算溶液中EC浓度。

1.3.5 数学模型的建立 根据测量原理和方法，按式(1)计算白酒中氨基甲酸乙酯含量。

(1)

式中：

X——样品中氨基甲酸乙酯含量，μg/kg；

c——样品溶液中氨基甲酸乙酯质量浓度，ng/mL；

V——样品处理后定容体积，mL；

m——样品质量，g；

R——回收率，取1。

2 结果与分析

2.1 测量不确定度分析

对于混合标准溶液：

(2)

由式(2)可知，标准溶液中目标物与内标浓度之比与定容体积无关，仅与溶液中目标物与内标质量之比有关，样品溶液亦如此，不必评定定容体积的不确定度[9-10]。

因此，测量结果X的不确定度分量：测量重复性s、样品溶液浓度c、样品质量m和回收率R；样品溶液浓度c的不确定度分量有混合标准溶液、曲线拟合及样品中加入内标使用液体积。

测量不确定度模型:X(u)=Fu[s、c、m、R]。

其中样品溶液浓度c的不确定度模型为：

c(u)=Fu′[cs、u(曲线拟合)、Vyis]=Fu′[(cs中、Vs中、Vis)、u(曲线拟合)、Vyis]。

具体不确定度来源因果图见图1。

图1 不确定度因果图Figure 1 Causal relationship diagram of uncertainty

2.2 测量不确定度评定

2.2.1 测量重复性不确定度urA样品平行6次，其测量结果见表1。

测量重复性不确定度为测量结果平均值的标准偏差，为A类标准不确定度，采用A类评定[11]。

表1 样品测量结果Table 1 Result of sample measurement

2.2.2 混合标准溶液cs的不确定度 混合标准溶液由标准中间液和内标使用溶液配制，需依次评定标准储备液、标准中间液和吸取溶液体积的不确定度。

(1) EC标准储备溶液的不确定度

① 标准品称量质量ms的不确定度：标准品称量质量0.103 5 g，因质量较小，质量不确定度仅由天平重复性引入[12]。天平检定证书显示天平重复性为0.2 mg，根据JJG 1036—2008《电子天平检定规程》，天平重复性为6次检定称量质量的极差，按极差法求得重复性标准偏差，6次极差系数C=2.53，去皮法称量2次，则质量ms的相对不确定度：

由环模制粒过程可知，物料在模孔受到来自模孔入口的挤压力和模孔内壁在横截面内的反向支撑作用力，如图4所示处于三向应力状态。取模孔中一微小物料颗粒段进行受力平衡分析，图中可见物料微元沿模孔轴线方向（x）受到上层物料的挤压力和下层物料的支撑力以及模孔内壁对其产生的滑动摩擦阻力。因此，物料微元要顺利从模孔中挤出需要满足式（1）所示微分平衡方程。

② 质量分数P的不确定度：氨基甲酸乙酯标准品质量分数P为99.5%，误差为±0.5%，服从均匀分布，相对不确定度：

EC标准储备溶液相对不确定度由标准品称量质量、质量分数、定容体积不确定度合成：

(2) EC中间液c中1(10.0 μg/mL)和c中2(0.50 μg/mL)的不确定度：量取1.00 mL EC储备液，甲醇定容于100 mL，制得EC中间液c中1(10.30 μg/mL)；再量取5.00 mL EC中间液c中1，甲醇定容于100 mL，制得EC中间液c中2(0.515 μg/mL)。

配制中间液及混合标准溶液温度为(24±2) ℃，温度引入的不确定度在配制混合标准溶液时合并评定[15]。

① 吸取储备液体积1.00 mL(V2)的不确定度：A级1.00 mL单标吸量管，容量允差±0.007 mL，按均匀分布，相对不确定度：

② 吸取中间液c中15.00 mL(V3)的不确定度：A级5.00 mL 单标吸量管，容量允差±0.015 mL，按均匀分布，相对不确定度：

③ 定容体积100 mL(V4)的不确定度：100 mL容量瓶均为A级，相对不确定度同ur1(V1)，即ur(V4)=ur1(V)=0.000 577。

EC中间液c中2(0.50 μg/mL)的相对不确定度：

(3) 混合标准溶液的不确定度评定：混合标准溶液的不确定度来源为EC中间液、吸取EC中间液体积及吸取D5-EC内标使用液体积。

① 吸取D5-EC内标使用液体积100 μL(Vis)的不确定度：因在混标和样品中D5-EC内标使用同一支移液器吸取相同体积100 μL，体积不确定度由移液器测量重复性引入。查JJG 646—2006《移液器标准》，100 μL测量重复性为1.0%，可直接引用，ur(Vis)=1.0%=0.010。

② 吸取EC中间液体积(Vs中)的不确定度：由移液器体积容量允差ΔV(容量允差见JJG 646—2006《移液器》)引入，按均匀分布计算：

(2)

③ 温度对吸取EC中间液的不确定度ur(Vst)：EC储备液在20 ℃配制，中间液和混合标准溶液在(24±2) ℃ 配制。温度升高导致溶液浓度降低，而移液器(移液枪)因温度升高导致其体积增大，可吸入更多的溶液。温度引入的不确定度由甲醇体胀系数、移液器体胀系数、温度差及温度波动共同作用；甲醇体胀系数β=1.2×10-3℃-1，移液器体胀系数β移=0.000 45 ℃-1[16]，温度差Δt1=24-20=4 ℃，温度波动半宽Δt2=2 ℃；温度差Δt1引入体积的系统误差，将其按均匀分布处理成系统不确定度，温度波动Δt2假设为均匀分布，则温度引入的相对不确定度为：

④ 各混合标准溶液浓度的相对不确定度：标准溶液系列各浓度不确定度由EC中间液不确定度、吸取体积不确定度(包含温度的不确定度)、吸取内标液体积不确定度引入，按式(3)计算。

ur(ci)=

(3)

经计算各浓度不确定度见表2。

表2 混合标准溶液各浓度的相对不确定度Table 2 Relative uncertainty of each concentration of mixed standard solution

⑤ 混合标准溶液系列的不确定度：以标准溶液系列的各相对不确定度的均方根作为混合标准溶液系列的不确定度[17]。

2.2.3 曲线拟合的不确定度 混合标准溶液各浓度测定2次，以平均值计算标准曲线。标准溶液系列测量结果及相关数值见表3。

表3 标准溶液系列测量结果Table 3 Result of standard solution measurement

样品溶液浓度由拟合曲线引入的不确定度为[18]：

(4)

式中：

s(Ar)——标准曲线峰面积比残差；

a——标准曲线的斜率；

P——样品溶液的测量次数；

N——标准溶液总测量次数；

c——样品溶液EC质量浓度平均值，ng/mL；

2.2.4 样品中加入内标使用液体积Vyis的不确定度 内标使用液体积100 μL的不确定为移液器测量重复性，ur(Vyis)=0.010。

2.2.5 样品质量m的不确定度 样品质量m=2.112 g，使用0.001 g电子天平。天平检定合格，检定证书显示天平示值误差E=0 mg，重复性m重=0 mg，则不确定度仅由天平分辩率d=0.001 g引入，质量称量两次，质量m的相对不确定度[12]：

2.2.6 回收率R引入的不确定度 采用样品加标的方法测量样品处理回收率。称量2 g样品，准确加入200 μL 0.515 μg/mL的EC中间液2，混匀后按1.3.2处理。回收率重复测量6次，结果见表4。

表4中，

表4 回收率测量结果Table 4 Result of recovery

(5)

(6)

平均回收率R的不确定度来源有回收率平均值的标准偏差和加标浓度两部分[20]。

(1) 回收率平均值的标准偏差：

(2) 加标浓度引入的不确定度ur(c加)：根据式(4)，加标浓度的不确定度分量有EC中间液2 浓度、吸取体积、样品质量3部分。因EC中间液2浓度不确定度包含在校准标准溶液中，不必重复评定，只需评定吸取体积、样品质量的不确定度。

① 吸取体积200 μL，容量允差按均匀分布计算：

2.2.7 合成标准不确定度 不确定度分量中测量结果重复性urA、标准溶液浓度ur(cs)、曲线拟合ur(c)、样品中加入内标ur(Vyis)(此3项合成得样品溶液浓度c的不确定度)、样品质量ur(m)均认为相互独立，合成得相对标准不确定度：

标准不确定度：uc=0.046 2×106=4.90 μg/kg。

标准不确定度主要来源见表5。

表5 标准不确定度来源Table 5 Source of standard uncertainty

2.3 扩展不确定度评定

取包含因子k=2，扩展不确定度U=k×uc=2×4.90=9.80≈10 μg/kg。

故白酒中氨基甲酸乙酯含量为(106±10) μg/kg，k=2。

2.4 影响因素分析

2.4.1 内标液质量浓度 使用同一份内标D5-EC使用液(2.00 μg/mL)，质量浓度及其不确定度与测量结果无关，因此在D5-EC标准品称量、定容、稀释等过程不必严格操作[8-9]，但在加入标准品、样品中量取体积应准确。在计算中或色谱软件中可直接以cD5=200 ng/mL计算。内标选择的原则是不得含有待测目标物，内标浓度应使内标信号强度适当，与目标物信号比例匹配。

2.4.2 定容体积 根据式(2)，混合溶液中质量浓度之比cs/cD5实际上是溶液中标准品与内标质量之比，与定容体积无关，因此所有混合溶液中均无需评定定容体积的不确定度[9-10]。混标可直接在气相用进样瓶中配制，体积不必准确。

2.4.3 温度 温度影响体积。既有温度不是定标温度20 ℃ 的影响，也有温度波动的影响；既有溶液体胀的影响，也有体积量器体胀系数的影响。玻璃量器体胀比溶液小得多，可忽略，但移液枪体胀系数不能忽略，特别是在混合标准溶液配制中需综合评定溶液和移液枪的体胀、温度对体积影响的不确定度。实际评定中，温度引入的不确定度(配制EC储备液及混标温度贡献仅占0.3%)较移液器体积允差(贡献占10.0%)小得多，亦可忽略不计。因此当检验室温度稳定，没有剧烈波动，试剂和溶液与检验室温度平衡时，温度引入的不确定度基本可以忽略。

2.4.4 回收率 同位素内标物与目标物具有非常相似的物理化学性质，在样品前处理或色谱响应上均表现出一致的特性，内标法加标回收率与1(100%回收)之间不会存在显著性差异[22]，从评定中也可发现加标回收率与1(100%回收)之间不存在显著性差异，对大多数内标法不必用样品加标法检验回收率。

3 结论

同位素内标法可自动校正进样体积、混合溶液定容体积的偏差，加标回收率基本可达到100%，这使得同位素内标法的重复性和准确性都要优于外标法。经评定，白酒中氨基甲酸乙酯测量结果为(106±10) μg/kg，k=2。主要的不确定度分量有：测量结果重复性(A类不确定度)、标准溶液浓度、曲线拟合及样品加内标液体积，其对测量不确定度的贡献分别为60.8%，16.4%，18.0%，4.7%。其中，标准溶液浓度和样品加内标液不确定度主要来源于所用移液器体积误差和重复性偏差，引入的不确定度合计贡献19.4%，占比高达92%。因此在日常检验中要特别加强移液枪类的计量检定和计量管理，尽量选用100 μL以上的体积，或者引用实际校准的容量误差，以降低其引入的不确定度。其他来源如质量、玻璃量器、温度等可忽略。可从增加平行样品检测次数、增加样品溶液进样次数以及减小曲线拟合的不确定度来提高检测准确度。