高效液相色谱法测定水果和蔬菜中维生素C含量的不确定度评定

王 霞 张维谊 韩奕奕 陈美莲 丰东升

(上海市农产品质量安全中心，上海 201708)

维生素C(Vitamin C)，又叫抗坏血酸，水溶性维生素的一种，是维持人体正常活动不可缺少的营养物质[1-2]。从结构上，维生素C分为左式(L型)和右式(D型)，左式维生素C包括还原型和脱氢型两种，其中还原型抗坏血酸极不稳定，易被氧化成脱氢抗坏血酸；脱氢L-抗坏血酸经L-半胱氨酸溶液还原后，采用紫外检测器测定L(+)-抗坏血酸总量[3-4]。维生素C广泛存在于新鲜水果和蔬菜中，其含量是评定蔬菜和水果营养价值的重要指标。

目前，维生素C含量的测定方法主要有滴定法、紫外分光光度法、荧光光谱法、高效液相色谱法等[5-8]。其中，高效液相色谱法因分离效果好、操作步骤简单、灵敏度高、准确度高等被广泛用于蔬菜水果中维生素C含量的测定。不确定度反映了测量值的分散性，是表征测量结果质量的指标，其数值大小反映了测量结果质量的高低，并影响检验结果的符合性判定[9-10]。关于荧光光谱法和紫外—分光光度法测定维生素C含量的不确定度评定的报道较多，而关于液相色谱法测定蔬菜和水果中维生素C含量的不确定度报告尚未见报道。文章拟依据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》和CNAS-GL 006：2019《化学分析中不确定度的评估指南》，对高效液相色谱法测定蔬菜和水果中维生素C含量进行不确定度评定，分析不确定度的主要原因，为科学评价测量结果的准确性和可靠性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-抗坏血酸：纯度98.5%，北京曼哈格生物科技有限公司；

甲醇：色谱纯，德国Merck公司；

L-半胱氨酸：优级纯，国药集团化学有限公司；

偏磷酸、磷酸三钠、磷酸：分析纯，国药集团化学有限公司。

1.2 主要仪器设备

高效液相色谱仪：Agilent 1260型，配有紫外检测器，美国Agilent公司；

天平：ML204型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

天平：MS105型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

pH计：S220型，精度±0.01，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

高速冷冻离心机：Heraeus X1R型，美国Thermo公司；

超纯水仪：Mill-Q型，德国 Merck公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理 根据GB 5009.86—2016中第一法，修改如下：称取样品约1.000 0 g于50 mL烧杯中，加入适量20 g/L的偏磷酸溶液进行搅拌、提取，重复2～3次，将试样转移至50 mL容量瓶中，定容；将样品溶液转移至50 mL 离心管中，超声提取10 min，4 000 r/min离心5 min。准确吸取20 mL上清液于另一50 mL离心管中，加入10 mL 40 g/L的L-半胱氨酸溶液，加入100 g/L磷酸三钠溶液，调节pH至7.0～7.2，涡旋、振荡，用磷酸调节pH至2.5～2.8，用蒸馏水将试液全部转移至50 mL容量瓶中，定容。混匀，样品溶液过0.45 μm水相滤膜后，供高效液相色谱仪检测分析。

1.3.2 色谱条件 色谱柱为C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温(25.0±0.5) ℃；紫外检测器波长245 nm；流动相为甲醇和20 g/L偏磷酸溶液(V甲醇∶V偏磷酸为3∶97)；流速0.7 mL/min；进样量10 μL。

2 试验与结果分析

2.1 数字模型

试样中维生素C含量按照标准曲线法计算，保留3位有效数字，其数学模型为：

(1)

式中：

X——试样中维生素C含量，mg/100 g；

Ci——从标准曲线得到的样品待测液中维生素C的质量浓度，mg/L；

V1——样品提取液总体积，mL；

V2——样品提取液V1中分取的溶液体积，mL；

V3——试样溶液最终体积，mL；

m——样品称样质量，g；

f——稀释倍数；

100、1 000——换算系数。

2.2 不确定度来源分析

测定过程中，水果、蔬菜中维生素C含量测定的不确定度来源如图1所示。

图1 高效液相色谱法测定水果和蔬菜中维生素C含量的不确定度来源Figure l Uncertainty source for the determination of vitamin C in fruits and vegetables with HPLC

(1) 标准品引入的不确定度。主要包括称量引入的不确定度，纯度引入的不确定度，标液配制、稀释过程中产生的不确定度，线性拟合引入的不确定度。

(2) 样品前处理引入的不确定度。主要包括样品称量引入的不确定度，样品定容、稀释过程中产生的不确定度。

(3) 样品检测重复性引入的不确定度。包括样品的均匀性和代表性、重复性进样、前处理过程的一致性及液相色谱仪响应和面积积分等因素引入的不确定度。

(4) 加标回收引入的不确定度。

2.3 不确定度的评定

2.3.1 标准品引入的不确定度

(1) 称量引入的不确定度：准确称取25.38 mg 维生素C (L-抗坏血酸标准品纯度98.5%)，用20 g/L的偏磷酸溶液定容至25.00 mL，得到质量浓度为1.0 mg/mL的标准储备液。

② 标准溶液稀释过程引入的不确定度：采用1 mL单标线吸量管移取储备液于10 mL容量瓶(A级)中，用20 g/L 的偏磷酸溶液定容，摇匀，得到质量浓度为0.1 mg/mL 的标准中间液。稀释过程中引入的不确定度主要来自于1 mL A级单标线吸量管和10 mL A级容量瓶引入的误差，计算过程同25 mL A级单线容量瓶，具体结果见表1。

表1 标准溶液配制、稀释过程玻璃量器引入的不确定度Table 1 The uncertainty from the preparation and dilution of standard solution by glass container

(4) 标准系列工作溶液配制过程引入的不确定度：配制质量浓度为1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/L 5个梯度的标准工作溶液，采用的量器有10 mL容量瓶和100，200，1 000 μL 移液器。配制过程中引入的不确定根据 JJG 196—2006《常用玻璃量具检定规程》和JJG 646—2006《移液器检定规程》规定的容量允许误差进行计算，同时考虑试验测试温度为(20±5) ℃，标准系列工作溶液配制过程中移液器引入的标准不确定度见表2。

表2 标准系列工作溶液配制移液器引入的不确定度Table 2 The uncertainty from the preparation of series standards solution by pipette

(5) 标准曲线拟合引入的不确定度：上述5种标准系列工作溶液重复测定3次，采用最小二乘对每个浓度峰面积y的平均值与质量浓度x进行拟合，线性方程如表3所示。

表3 标准曲线结果Table 3 Results of standard curve

由标准曲线拟合引入的不确定度

(2)

(3)

式中：

a——线性拟合方程斜率；

N——样品溶液待测组分测定次数；

n——标准系列工作溶液总的测定次数；

C0——样品溶液中待测组分的质量浓度，mg/L；

Ci——各标准工作溶液的质量浓度，mg/L；

SR——标准溶液峰面积残差的标准差;

Ai——标准溶液的峰面积[12]。

综上，整个检测过程中，标准物质各分量合成的相对不确定度为

2.3.2 样品前处理过程引入的不确定度

表4 样品提取、稀释过程吸量管和容量瓶引入的不确定度Table 4 The uncertainty from pipettes and volumetric flasks during the extraction and dilution of sample

综上，样品前处理过程中，各分量合成的相对不确定度为

2.4 测量不确定度的评定与报告

2.4.1 合成标准不确定度 辣椒中维生素C含量的合成相对标准不确定度为

橙子中维生素C含量的合成相对标准不确定度为

2.4.2 扩展不确定度 根据 CNAS-GL006:2019《化学分析中不确定度的评估指南》，扩展不确定度由合成标准不确定度乘以包含因子得到。取置信水平 95%，则k=2，辣椒中维生素C含量的扩展不确定度为U(X)=urel(X)×X×2=2.03%×33.7×2=1.4 mg/kg；橙子中维生素C含量的扩展不确定度为：U(X)=urel(X)×X×2=2.04%×42.3×2=1.7 mg/kg。

2.4.3 测定结果 采用高效液相色谱法测定辣椒和橙子中维生素C，当取样量为1.000 0 g，k=2 (置信水平95%)时，辣椒中维生素C含量为(33.7±1.4) mg/kg；橙子中维生素C含量为(42.3±1.7) mg/kg。

3 结论

从样品的称量、提取、稀释及标准物质的称量、配制、线性拟合以及测量的重复性等方面对高效液相色谱法测定蔬菜和水果中维生素C含量的不确定度进行了分析与评定。结果表明，高效液相色谱法测定蔬菜和水果中维生素C含量的不确定度主要来源于标准物质的纯度、配制及标准曲线的拟合过程，其次是测试的重复性和回收率，样品的前处理过程影响较小。针对水果、蔬菜中维生素C含量的测定，国家标准中规定了液相色谱法、荧光光度法和滴定法，试验仅对液相色谱法进行了不确定度评估，未对另外两种方法进行不确定度评估，后续有待进行另外两种方法的不确定度评估，并进行3种方法的比较。