精子线粒体功能检测与男性不育相关性的研究进展

李红林，傅广波，吕述彦（南京医科大学附属淮安第一医院生殖医学中心，江苏淮安223300）

不孕不育症指育龄夫妇未采取任何避孕措施，有规律性生活12个月内女方未获得临床妊娠［1］。据WHO估计全球约有1.9亿人患有不孕不育症［2］，其中约50%是由男方因素导致的不育症［3］。临床工作中，男性不育症的筛查和诊断主要是依据精液量、精子浓度、精子活力和精子形态等指标的检验结果［4-5］，但大约30%～50%的特发性男性不育症患者的精液常规检验指标却完全正常［6］。线粒体是唯一含有独立基因组的细胞器，通过氧化磷酸化产生的适量活性氧（ROS）和三磷酸腺苷（ATP）维持精子活力、获能、顶体反应和DNA完整性［7］。精子线粒体损伤会引发能量合成障碍，导致精子质量和功能下降、甚至消失。现对近年来应用精子线粒体分子结构和功能检验指标评估男性生育力的研究进展作一综述，为男性不育症发病机制的研究以及精子线粒体功能检测指标的临床应用提供参考。

1 精子线粒体功能与ROS

精子细胞中线粒体数超过103个/细胞。精子发育成熟过程中，随着其他细胞器和细胞质的消失，线粒体的数量和结构也发生显著变化，当精卵结合形成受精卵时，精子线粒体会通过自噬途径被完全降解清除［8］。在成熟精子中仅有约80个线粒体［9］，首尾相连并螺旋形地缠绕在鞭毛周围，形成厚的线粒体鞘，位于精子尾中部的外质膜下方［10］，是精子内能量转换和新陈代谢的关键部位，与精子的发生发育、凋亡和受精过程密切相关，其功能主要有［11］：（1）通过氧化磷酸化合成ATP，为精子运动提供主要的能量来源；（2）通过“固有”凋亡途径调控精子凋亡，维持男性生育力；（3）产生ROS；（4）维持精子内钙稳态；（5）参与类固醇激素的生物合成；（6）维持人类精子顶体酶活性、顶体反应和染色质完整性，直接影响精子的受精能力［7］。其中精子线粒体氧化磷酸化过程中产生的ROS是一把双刃剑：适量的ROS是精子酪氨酸磷酸化-去磷酸化、胆固醇外排的必要条件，参与精子成熟、获能和精卵结合过程；但精索精脉曲张［12］、环境污染［13］、药物［14］、高温、吸烟、肥胖等因素引起精子产生过多ROS而又无法及时清除时，会导致氧化应激，引起脂质过氧化、ATP生成减少，损伤精子DNA（包括线粒体DNA）和线粒体膜，导致线粒体膜电位（MMP）下降，破坏轴丝、鞭毛等结构，诱导生殖细胞凋亡，降低精子浓度、活力，增加精子畸形率，从而影响男性生育力。辅酶Q10、维生素E等抗氧化剂则可降低ROS、改善精子质量，提高男性生育力［15］。

2 精子线粒体膜电位（MMP）与男性不育

精子线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）是指在精子能量代谢过程中，电子经呼吸链传递产生ATP，同时复合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ将质子从线粒体内膜基质侧泵至内膜外所形成的跨膜电位差。在正常的线粒体中，跨膜电位差反映了电子传输和氧化磷酸化的过程，该过程驱动线粒体ATP的产生。因此，MMP是反映精子线粒体功能的关键指标。

MMP可反映精子质量与线粒体功能之间的密切关系。早在1982年，Evenson等［16］就发现弱精子症患者精子MMP水平较低。研究进一步证实MMP与精子活力、正常形态之间存在相关性［17］。杨颖等［18］报道弱精子组MMP低于对照组，且MMP与精子活动率、前向运动精子百分率及正常形态精子百分率呈正相关。Zhang等［7］报道正常水平的精子MMP是维持精子顶体酶活性和染色质完整性的生理基础，MMP低的精子不易进行顶体反应。因此，国外学者建议对不明原因不育夫妇且男方精子MMP水平较低时，采用卵细胞质内单精子注射技术（ICSI）治疗［19］。MMP和精子DNA碎片指数（DFI）联合预测女性配偶自然受孕的能力优于精液常规参数［20］，是临床评估特发性男性不育的重要指标［21］。

精子冷冻复苏过程会导致线粒体超微结构紊乱，ROS生成增加，ATP生成减少、MMP下降。在冷冻保护剂中补充抗氧化剂左卡尼汀［22］、白藜芦醇［23］等则可明显改善冷冻损伤后精子的MMP水平，从而提高精子活力和存活率。这可能是因为抗氧化剂清除了线粒体膜上过量的长链脂肪酰基，维持线粒体膜通透性转换，抑制线粒体电子传递链系统释放电子，减少了ROS生成。

3 精子线粒体DNA（mtDNA）与男性不育

线粒体不同于其他细胞器的特征是其含有独立的基因组，即线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），含37个基因，可编码13种多肽参与氧化磷酸化过程。mtDNA是无保护性组蛋白的环状双链结构，可通过高速D环复制方法独立于核DNA进行复制，且无修复系统。因此，与核基因组相比，它更容易被氧化应激破坏［24］。

3.1 mtDNA缺失 在氧化磷酸化缺陷患者的线粒体基因组中已鉴定出超过50个点突变和大量复杂的重排，如缺失和重复。mtDNA缺失（mtDNA deletion，mtDNAdel）主要发生在2个mtDNA复制叉之间的大弧中。4 977位点缺失是少精子症和弱精子症患者mtDNAdel发生率最高的位点，缺失频率与8-羟基-2-脱氧鸟苷（氧化性DNA的生物标志物）含量之间存在正相关，说明ROS引起的DNA氧化损伤可能被固定为精子线粒体中mtDNA的大规模缺失［25］。弱精子症患者精子mtDNA较常见的缺失位点还有7 345、7 436、7 599、4 866位点等［26-31］，且常发生大规模的mtDNA多个位点缺失。由缺失mtDNA编码的呼吸链蛋白质多存在功能缺陷，会增强ROS或自由基产生，引发ATP生成障碍，进一步损伤mtDNA，如此恶性循环导致精子陷入能量危机和活力下降，造成男性生育力低下。

3.2 mtDNA拷贝数变异 拷贝数是指某基因在某一生物基因组中的个数。mtDNA拷贝数（mitochondrial DNA copy number，mtDNAcn）是指每个精子中的mtDNA数。正常成熟精子总共约有1 000～1 500个mtDNAcn。mtDNAcn变异被认为是导致男性不育的一个重要因素。Rosati等［30］从美国16个县招募了384对夫妻，检测了男方精液样本的mtDNAcn和mtDNAdel，并用离散时间比例风险模型评估1年内女性伴侣怀孕概率，结果表明mtDNAcn可能是男性生育力更准确的预测指标。Wu等［32］报道在实施人类辅助生殖技术的人群中，精子mtDNAcn变异和mtDNAdel与受精率均呈负相关，与受精后第3天的优质胚胎率呈正相关。但Tiegs等［33］报道精子mtDNAcn在接受ICSI治疗的不育人群中，不能预测卵子受精率、可利用胚胎率和活产率。研究结论差异可能与研究所选人群不同有关，需进一步扩大研究人群样本量和种族。

3.3 mtDNA点突变 除mtDNA缺失位点、频率和拷贝数异常与男性不育密切相关外，mtDNA点突变也可能影响线粒体蛋白功能，导致精子ATP生成减少，影响精子活力。Baklouti-Gargouri等［34］研究发现所有弱精子症患者精子mtDNA均发生了细胞色素氧化酶Ⅲm.9588G＞A的突变。Holyoake等［35］研究发现mtDNA ATPase6基因上T8821A位的点突变可能因影响精子成熟而引起男性不育。但也有文献报道［36］，大多数与男性不育相关的mtDNA多态性在普通人群中更为普遍，两者之间没有关联性。Mao等［37］最新报道显示，在使用体外受精/卵细胞质内单精子注射（IVF/ICSI）受精失败的人群中，精子线粒体还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脱氢酶亚基5（ND5）和NADH脱氢酶亚基6（ND6）基 因 中C12417T、C13650A、C13765A、T13769C、C13785A和C13845T等6个位点的基因变异率在受精失败人群中高于正常受精组，提示这些mtDNA位点突变与精子的受精能力密切相关。未来需进一步探索引起男性不育的特异性mtDNA突变位点，为男性不育的基因诊断和科学防治提供依据。

4 精子线粒体功能检验

线粒体鞘由富含半胱氨酸和脯氨酸的硒蛋白组成，该结构蛋白中含多个二硫键，在成熟的精子中无酶活性，导致精子线粒体特别难以分离，因此大多数对精子线粒体功能的测定都利用原位分析或去膜精子。目前，评估精子线粒体与男性生育力关系的检验指标有精子线粒体的超微结构、mtDNA点突变、mtDNA重复或缺失、精子线粒体完整性、mtDNA拷贝数、ROS、MMP水平、线粒体活性和线粒体钙离子水平［24］等。目前，使用较广泛的指标是精子MMP水平和mtDNA的分子生物学检验。

4.1 MMP检验 MMP水平不仅反映精子线粒体的能量状态，还与精子活力密切相关，因此，国外学者建议将精子MMP作为评估男性不育的常规指标［17］。通常选用5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′-四乙基苯并咪唑羰花菁碘化物（JC-1）、四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐（TMRM）、罗丹明123（Rh123）等荧光探针染色线粒体，经荧光显微镜或流式细胞术检测MMP。人类精子MMP检测常用荧光染料的比较见表1。其中JC-1作为荧光染料检测精子MMP水平［4］，是评估精子线粒体功能的特异性高、可靠性强的最为常用的方法。该方法的原理是精子MMP水平正常时，JC-1因极性作用进入线粒体内，并随着浓度增高而形成发射红色荧光的多聚体，当精子MMP水平降低时，线粒体内JC-1浓度降低，并逆转为发射绿色荧光的单体形式，因此可通过检测荧光变化来检测MMP水平。但该方法检测抗氧化剂治疗过的精子标本时，MMP检验结果与精子活力、ATP浓度多不一致，因此，Uribe等［38］推荐当精液中存在抗氧化剂时，应用TMRM作荧光探针检测精子MMP的变化。TMRM进入精子并积累在线粒体中，并随着线粒体膜电位的增加发出红色荧光。

表1 人类精子MMP检测常用荧光染料比较

4.2 mtDNA分析 mtDNA突变包括缺失、点突变和重排突变。mtDNA的缺失型与野生型能共存于同一细胞，这种现象称为mtDNA异质性。mtDNA异质性的存在增加了其检测难度。目前多采用实时荧光定量PCR技术检测其拷贝数或运用长链PCR结合引物迁移技术检测其完整性，线粒体全基因组测序技术通量大、覆盖度广，可检测mtDNA未知变异，但因成本高昂、多用于科学研究。精子mtDNA检验常用引物见表2。

表2 精子mtDNA检验常用PCR引物

5 总结

精子线粒体具有不同于其他体细胞线粒体的独特特征，影响着精子的活力、获能、顶体反应和最终受精能力等。MMP水平的变化、mtDNA突变或缺失均可引起精子能量合成障碍，导致男性不育。mtDNAcn是评估男性生殖健康及预测其女性配偶成功妊娠的生物标志物。MMP的检测通常使用JC-1探针，必要时应选用TMRM，以避免抗氧化剂对检测结果的干扰。