胚胎植入前遗传学检测技术在环状染色体携带者助孕中的应用价值*

陈虹，解洪强，赵丽娟，刘晓丹，刘敏，傅海龙，刘燕，邱松，高选（山东大学附属生殖医院，济南250021）

胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）是在胚胎移植之前通过对配子或胚胎进行遗传学分析，从而选择植入未见异常的胚胎，以提高着床率和活产率［1］。PGT包括非整倍体植入前基因检测（preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A）和植入前结构重排基因检测（preimplantation genetic testing for structural rearrangement，PGT-SR），其中PGT-SR是针对染色体异常的夫妇在植入胚胎前检测易位染色体的不平衡胚胎和非整倍体胚胎，以降低流产风险［2］。

环状染色体（ring chromosome）是一种环状DNA分子，在真核生物中发生频率较低，大约为1∶50 000［3］。研究发现，环状染色体在胚胎发生过程中常会导致各种表型，主要是伴随着缺失和重复引起［4］。Mantzouratou等［5］用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）检测1例环状22号染色体携带者的胚胎，在12枚胚胎的卵裂球中仅有1枚被诊断为未见异常胚胎，但此胚胎未发育到囊胚期。FISH只能检测有限数量的染色体［6］且活检时期在卵裂阶段，其空间分辨率受杂交失败或信号重叠、散射等因素影响［7-9］，诸多因素会影响其结果准确性。二代测序技术（next generation se-quencing，NGS）逐渐应用于临床，其不仅能够同时分析所有染色体，还能够检测染色体非整倍体异常，具有检测效率高、通量高、分辨率高、检测成本低等优势。

为获得胚胎植入前遗传学筛查技术在环状染色体患者助孕中的临床诊断价值，本研究回顾性分析1例环状染色体携带者，为临床环状染色体的遗传咨询提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 患者女，30岁，2012年结婚，性生活正常，未采取避孕措施，5年未孕。2016年期间采用指导同房和体外授精助孕，均未孕。2017年10月于我院行供精人工授精（artificial insemination with donor semen，AID）未孕后检测夫妻双方染色体并要求行PGT助孕。本研究方案已通过山东大学附属生殖医院医学伦理委员会批准，批准文号：［2020］伦审字（3）号，患者签署了知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂 1640培养基、秋水仙素（杭州浩仁医药公司）；Gsl-120自动扫描仪（德国Leica公司）；全基因组扩增试剂盒、Veriseq DNA Library文库构建试剂盒、Miseq Reagent Kit测序试剂盒、Miseq测序平台（美国Illumina公司）。

1.3 外周血染色体核型分析 无菌条件下采集患者4 mL外周血，用1640培养基37℃恒温培养68～72 h；用1 mL注射器垂直加入60μL 40μg/mL秋水仙素，继续培养1.5 h后进行细胞收获；常规G显带后在Gsl-120自动扫描仪扫描分析，计数20个中期分裂相，分析5个。

1.4 胚胎植入前遗传学检测

1.4.1 囊胚活检 患者在第1周期采用长效促性腺激素释放激素激动剂（gonadropin releasing hormone agonist，GnRH-a）方案，第2周期使用拮抗剂方案进行卵巢刺激，卵母细胞均采用胞质内单精子注射授精，胚胎采用玻璃化冷冻保存。对培养到囊胚期的胚胎，在滋养外胚层活检3～5个细胞，活检后将细胞立即放入2.5μL 1×PBS的PCR管中，如不能立即检测则-20℃冻存［10］。

1.4.2 遗传学检测 活检后的细胞使用Sureplex方法进行全基因组扩增。全基因组扩增后的DNA经酶切打断后形成小的DNA片段，加入文库构建试剂盒内的T4聚合酶将DNA片段末端补平，增加一个腺嘌呤脱氧核苷酸。随后T4 DNA连接酶通过TA连接法将测序通用引物与末端补平后的DNA连接，完成文库构建。构建好的文库分子与测序芯片表面的共价结合的引物互补配对，固定到芯片表面，通过桥式PCR扩增形成DNA序列片段，基于可逆末端终止法和边合成边测序的化学原理，读取DNA片段的序列数据，最终使用BlueFuse Multi进行数据分析来获得样本染色体拷贝数的评价结果。

1.5 胚胎移植 胚胎发育至囊胚期，根据卵裂球大小、规则性、胞质折光性和碎片多寡等形态学指标评估胚胎的质量，结合NGS检测结果，选择1个形态学较好且染色体整倍性的胚胎植入母体子宫，其余符合冻存条件的胚胎冷冻保存。

2 结果

2.1 夫妻双方外周血核型结果 女方外周血核型结果为：46，XX，r（22）（p11.2q13）；男方核型结果为：45，XY，der（13；14）（q10；q10）。见图1。

图1 染色体核型结果

2.2 胚胎检测结果 经NGS检测后，患者第1周期1枚胚胎为非整倍体胚胎，第2周期有2枚胚胎为非整倍体胚胎，2枚胚胎为整倍体胚胎。非整倍体胚胎检测结果均为21号染色体单体。见图2。

图2 胚胎检测结果

2.3 胚胎移植、产前诊断及妊娠结局 患者选择第2周期的1枚整倍体胚胎进行植入，植入后获临床妊娠，随访其产前诊断结果为46，XN，r（22）（p11.2q13），见图3。最终获活产女婴，表型正常。

图3 产前诊断羊水核型结果

3 讨论

本文通过对1例22号环状染色体携带者家系进行回顾性研究，使用NGS排除了非整倍体胚胎以后，移植整倍体胚胎后获得了健康女婴。这是首次用NGS在胚胎植入前对环状染色体的家系进行筛查，也是首次通过PGT筛查后获得未见异常胚胎且活产的报道。

本研究中，共检测了5枚胚胎，其中有3枚胚胎为非整倍体，异常率为60%，且非整倍体结果均为22号单体，说明在减数分裂的过程中，环状染色体会发生丢失的情况。如果患者未进行PGT检测，至少移植3次才能获得正常胎儿的活产，PGT能够排除60%的非整倍体胚胎，这个异常率要明显低于之前报道的12个卵裂球中仅有1个正常的概率［5］，出现这种情况的原因可能有2个：一是之前报道中使用样本为卵裂球，本研究中使用囊胚滋养外胚层细胞，可能在胚胎发育过程中会有一部分非整倍体被淘汰［11］；二是之前的报道中使用的方法为FISH，本研究中使用NGS方法进行检测，FISH的准确性在之前研究中其误诊率较高［12］。

本研究中移植的未见异常胚胎产前诊断结果为22号环状染色体，并未见到22号染色体的片段缺失，可以推断患者环状染色体形成的模式是由22号染色体端粒连接而形成，根据之前的报道这种形成方式未造成遗传物质的丢失［13］。此种情况下环状染色体的携带者通常为正常的，其携带状态的发现主要是在接受检查时发现，如妊娠失败或子女异常时［14-16］。本研究对象表型正常，因多年未孕进行染色体检测，与之前报道相符。

环状染色体在有丝分裂过程中是不稳定的，经常会导致嵌合体和生长缓慢［17］。但在本研究中，女方携带者及其子代羊水穿刺结果显示均未有嵌合体的情况发生。在之前关于22号环形染色体的报道中也很少有嵌合体发生［18-19］。因此，环状染色体在有丝分裂过程中产生嵌合体的原因还有待进一步阐明。

NGS技术虽能排除非整倍体胚胎，但依然无法分辨正常胚胎和环状染色体携带型的胚胎。因此，建议患者在进行了胚胎植入前遗传学检测后，依然需要进行羊水穿刺确认。

本文患者为女性携带者，在之前研究中显示男性携带者遗传给子代的报道非常罕见。因此，男性携带者是否需要进行胚胎植入前遗传学筛查还需进一步研究。

综上所述，环状染色体携带者会产生异常胚胎，在进行胚胎植入前遗传学检测后，可以排除非整倍体胚胎，获得健康胎儿。但在获得临床妊娠后需进行羊水穿刺核型检测确认子代核型。