新冠病毒核酸检测实验室核酸污染监测及排除

段 植，王 琴，张 浩，周 强

（安徽医科大学第二附属医院检验科，安徽 合肥 230601）

截至2021年8月新型冠状病毒（SARS-CoV-2）已席卷212个国家，全球累计确诊超过两亿 人，死亡超过400万 人，其主要传播途径经呼吸道飞沫和密切接触传播[1]。对于中国来说最近几次的区域性疫情表明无症状感染者成为了疫情传播和反弹的焦点[2]。而针对于此最有效的方式是进行新冠核酸检测。目前来说临床上使用最广泛和技术较成熟的新冠核酸检测方法是实时荧光逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），RT-PCR检测SARS-CoV-2核酸过程中将RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行扩增，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行跟踪并进行产物分析[3]。尽管PCR技术有很多的优点，但是由于其超高的灵敏度，一旦出现实验室核酸污染，很容易导致假阳性结果，影响检测的准确性[4]。本文结合本实验室在开展新冠核酸检测时遇到的实验室污染问题，进行的一系列环境消毒监测实验等进行总结。

1 材料与方法

1.1 实验室概况 新冠实验室为负压实验室，实验区分为试剂准备区、核酸提取区、扩增分析区3个区，各区之间试剂、样本等以相应的传递窗单向传递，另外还有样本接收区和消毒区等。

1.2 试验材料 圣湘Natch 96全自动核酸提取仪、ABI QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪、微米一次性病毒采样管（WM-1）及采样拭子、圣湘新型冠状病毒核酸检测试剂盒。

1.3 环境监测样本的采集和处理

1.3.1 采样点设置：结合新冠实验室的环境以及工作流程，选取样本接收、核酸提取、样本扩增以及废弃物处理等高风险实验活动区域为采样对象，具体采样信息见表1。

1.3.2 采样方法：采用空气沉降法和表面擦拭法，分别对上述各采样点进行采样。空气沉降法取样：在各采样点放置1 个样本管，每管3 mL生理盐水暴露放置6～12 h后进行核酸检测；物体表面擦拭法采样：参考WHO推荐的方法，拭子充分浸润病毒保存液后表面重复涂抹、并将拭子放回采样管进行浸润，取出后再次涂抹采样，重复3 次以上。对表面较大的物体进行多点分布式采样[5]。

1.4 检测方法 此次实验室污染是以生理盐水作为阴性质控出现内对照阳性后停止临床样本检测，进行环境以及物体表面采样后，采用圣湘Natch 96全自动核酸提取仪进行病毒RNA的提取，提取产物用圣湘新型冠状病毒核酸检测试剂盒在ABI QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪上检测新冠实验室环境以及物表样本。每次监测试验结束后进行空气以及物体表面消毒并每隔6～12 h再次消毒，于第二天再次进行采样监测分析污染情况。

1.5 空气以及污染部位的消毒方法 实验室内空气在负压正常且无人条件下用过氧乙酸消毒剂，采用超低容量喷雾法进行消毒，郭灵安等[6]的研究表明再用可移动紫外推车配合实验室顶部紫外灯进行照射过夜会有更好的效果。物体表面应先清除污染物再进行消毒，用有效氯1 000 mg/L的含氯消毒液进行喷洒、擦拭或浸泡消毒，作用30 min后清水擦拭干净[7]。

1.6 污染清除的验证方法 根据表1进行环境以及物体表面采样、4 个阴性样本和1 个弱阳性质控一起进行提取、扩增。环境和物体表面监测结果靶基因以及内参基因阴性，阴性样本靶基因阴性、内参基因阳性，弱阳性质控靶基因和内参基因均阳性则表示在控。

2 结果

2.1 实验室环境靶基因RT-PCR检测结果 此次检测的基因为两个靶基因ORF1ab基因和N基因。环境监测每天进行检测，分析发现靶基因在部分监测点检出阳性，其中以门把手、扩增仪等高频次接触的物体表面出现污染较常见，这和Lv等[8]对核酸检测实验室物体表面残留物的研究结果基本相符，Ct值均较大，荧光强度值较低，随着每天消毒的规律进行，较快转为阴性（见表1）。

表1 新冠实验室环境以及物体表面检测结果

2.2 实验室环境内参检测结果 环境监测实验中发现内参基因污染较严重，初次环境监测采样几乎各实验区域均能检测出内参（见表1）。对其中内参污染严重的监测点（扩增区门把手，PCR仪内，消毒间门把手等）进行规律消毒，连续监测内参Ct值的动态变化（见图1，图2）。随着每天进行规律多次消毒，内参污染渐渐好转，但持续周期较长。其中，扩增区门把手等污染较严重区域经过多次消毒，内参Ct值呈持续升高趋势，说明核酸浓度逐渐稀释，持续5 d左右，内参检测结果均显示no Ct，即转为阴性。因新冠核酸扩增试剂扩增循环数为45，将内参检测结果阴性的默认Ct值设为45。

图1 内参污染较严重区域（接收区地面，消毒间门把手，PCR仪内，扩增区门把手）的内参监测Ct值

图2 内参污染较严重区域（接收区地面，消毒间门把手，PCR仪内，扩增区门把手）的内参监测Ct值的动态变化趋势

2.3 污染清除的验证结果 环境和物体表面监测结果靶基因（ORF1ab和N基因）以及内参基因阴性，阴性样本靶基因阴性、内参基因阳性，弱阳性质控靶基因和内参基因均阳性表明实验室核酸污染清除，具体曲线见图3、图4、图5，实验室可正常进行临床样本检测[9]。

图3 经5 d消毒后的环境以及物体表面监测、阴性样本ORF1ab基因阴性，弱阳性质控ORF1ab基因在控

图4 经5 d消毒后环境以及物体表面监测、阴性样本N基因阴性，弱阳性质控N基因在控

图5 经5 d消毒后环境以及物体表面监测内参基因均为阴性，4 个阴性样本、1 个弱阳性质控内参基因在控

3 讨论

靶基因ORF1ab基因和N基因污染原因分析：新冠实验室出现靶基因阳性污染并非一定是临床阳性标本污染导致，更多的可能是新冠病毒核酸片段导致，可能来源于阳性质控品的扩增产物片段。以本实验室为例，近期并未检测出新冠核酸阳性的临床标本，分析原因可能为：(1)阳性质控品对样本的污染：阳性质控品和临床样本一同使用磁珠法进行提取，而在磁珠法提取过程中很容易造成阳性质控品气溶胶溢出污染其他临床样本甚至于污染核酸提取仪。故实验室进一步选用浓度较低的弱阳性质控[7]。(2)提取以及扩增产物的不合理处理：新冠核酸样本以及质控品的提取产物尤其是扩增产物一旦进行高压处理很容易造成整个实验室环境的污染。(3)加样枪以及耗材造成的靶基因污染：阳性质控品加样枪不能混用，一旦阳性质控品加样枪受到污染会造成标本大范围污染，所以质控品加样枪应和普通临床样本加样枪做好标记，分开使用。而耗材尽量选用一次性耗材且以小包装为宜。

内参基因污染原因分析：圣湘新型冠状病毒核酸检测试剂盒采用的是内源性内参RNase P，日常检测的临床样本大多为内参阳性，因此内参污染的风险远远高于2019-nCov靶核酸。如果内参污染，将失去对标本采集、核酸提取和扩增过程的监测作用[10]。因此我实验室在日常检测中是通过检测不含内对照的阴性质控品如生理盐水以监测内对照污染的发生情况。(1)新冠实验室医疗废物的不合理处理：提取产物尤其是扩增产物进行高压处理会造成内参基因外溢，造成整个实验室的污染，此种内参污染最为常见。(2)加样枪以及耗材造成的内参污染：新冠实验室需尽量使用一次性耗材，比如使用商品化盒装的枪头，小包装的八连管耗材。而加样枪因为每天要处理大量的新冠临床样本，一旦加样枪在使用过程中出现污染将会导致样本的大范围污染。

本实验室定期进行环境监测且之前极少出现靶基因和内参基因污染的情况，此次发现实验室污染尤其是内参污染严重，而消毒间的环境和物体表面监测结果荧光强度值最高。经调查发现是由于处理医疗废物时误将扩增产物高压导致整个实验室出现大面积的内参基因污染。

在低风险区，因新冠核酸检测靶基因阳性率很低，因此对于实验室污染的监测，监测内参污染就显得尤为重要。新冠实验室的污染重在预防，而且内参污染更为常见且容易被临床实验室忽略。实验室不仅要制定科学合理的实验室相关制度、程序、操作规程，而且要做到定期对实验室进行监控，尤其是对潜在污染区的管理，及时发现和清除污染，保证实验室的检测质量。而一旦出现新冠实验室污染的情况，应立即暂停临床样本检测，待污染清除验证通过后方能进行正常实验。