大蒜素促进膀胱肿瘤细胞T24凋亡的JAK/STAT3通路机制研究

王相平，纪煜航，郑 超，李 娜，李 镇

（大连市第五人民医院泌尿外科，辽宁 大连 116027）

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率有逐年升高的趋势[1-2]。膀胱癌主要发生于膀胱黏膜，占我国泌尿系统恶性肿瘤的首位[3-4]。膀胱癌的发病与多种因素相关，如遗传因素、吸入芳香族化合物等环境因素等[5]。但是目前关于膀胱癌发病的确切机制尚不明确。

JAK/STAT通路是细胞内多种信号通路的共同途径，是细胞外信号向细胞内转导并诱导细胞核基因转录的关键途径[6]。JAK/STAT通路参与了多种疾病的发生及发展过程，如心肌缺血再灌注损伤、肾功能损伤及肾纤维化、心肌细胞损伤及心功能异常、脑组织疾病等[7-9]。已有的证据也表明，JAK/STAT通路也与多种肿瘤的病理学过程，如增殖、分化、转移、血管生成及凋亡等过程密切相关。大蒜素是存在于大蒜鳞茎中的具有抑菌作用的三硫代丙烯醚类化合物，具有降固醇、促进血小板凝集及抗肿瘤的药理活性[10]。本研究旨在探讨膀胱肿瘤细胞T24凋亡的JAK/STAT3通路参与作用及大蒜素促进细胞凋亡的相关机制，为相关治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 人T24细胞株购自中科院上海细胞研究所；DMEM培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；二甲亚砜（DMSO）购自美国Sigma Aldrich公司；MTT及JAK抑制剂ADZ1480化合物购自美国Sigma Aldrich公司；Caspase 3及Caspase 9单克隆抗体购自美国Abcam公司；Bax及Bcl2单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；JAK1、JAK2及JAK3单克隆抗体购自美国R&D公司；STAT1单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；STAT3单克隆抗体购自Omega公司；HRP标记二抗购自南京建成生物工程研究所；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥公司。细胞培养箱购自上海新苗仪器有限公司；蛋白垂直电泳购自北京六一仪器厂；半干法转膜系统购自美国ABI公司；硝酸纤维素膜购自默克密理博公司。

1.2 分组及处理 培养状态良好的T24肿瘤细胞完全随机分为5组：对照组、ADZ1480组和大蒜素1、2、3组。ADZ1480组细胞进行10 μmol/L ADZ1480孵育处理，大蒜素1、2、3组细胞分别给予大蒜素1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L孵育处理。分别于处理24、36、48和72 h后分析细胞增殖抑制率，处理72 h后检测相关蛋白分子的表达变化。

1.3 噻唑蓝（MTT）法检测肿瘤细胞增殖情况 各组细胞经相应浓度药物处理后于37 ℃、5% CO2条件下分别培养24、36、48及72 h，弃去培养液并加入适量MTT继续培养4 h；然后在细胞培养板的培养孔中加入DMSO剧烈振荡，采用全波长酶标仪检测培养后细胞培养板各个孔的吸光度值，计算药物对细胞T24的增殖抑制率。计算公式：抑制率＝(对照组吸光度－试验组吸光度)/对照组吸光度×100%。

1.4 Western blotting法检测蛋白表达 人膀胱癌细胞T24经相应药物处理后用无菌PBS冲洗3 次，然后于0 ℃水浴中进行匀浆并提取总蛋白质。考马斯亮蓝法进行定量后以等量总蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳溴酚蓝条带至凝胶下端后进行半干法转膜。转至硝酸纤维素膜上后胎牛血清封闭。然后与一抗（1:250）在室温条件下培养过夜，无菌PBS漂洗后与HRP标记二抗（1:200）在室温条件下杂交1 h，显色。分析显色后条带的光密度，并以β-actin为内参进行相关蛋白表达的定量分析。

1.5 数据统计 数据统计采用SPSS 19.0统计软件完成，计量资料以平均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，计数资料采用卡方检验。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大蒜素促进膀胱肿瘤细胞T24细胞凋亡蛋白Caspase 3/9上调表达 研究发现JAK抑制剂ADZ1480处理细胞后细胞凋亡蛋白Caspase 3及Caspase 9的表达明显升高，且与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01），同时，大蒜素1组和2组的细胞凋亡蛋白表达也明显升高，且具有剂量依从性效果（P＜0.05，P＜0.01）。（图1）

图1 Western blotting分析细胞凋亡蛋白分子在不同药物处理膀胱癌肿瘤细胞中表达的差异性

2.2 大蒜素促进膀胱肿瘤细胞T24细胞凋亡蛋白Bax/Bcl2异常表达 研究发现JAK抑制剂ADZ1480处理细胞后细胞凋亡蛋白Bax的表达明显升高，而抑制凋亡蛋白Bcl2表达明显降低，且与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01），同时，大蒜素1组和2组的上述细胞凋亡蛋白表达也明显变化，且具有剂量依从性效果（P＜0.05，P＜0.01）。（图2）

图2 Western blotting分析Bax/Bcl2蛋白分子在不同药物处理膀胱癌肿瘤细胞中表达的差异性

2.3 大蒜素抑制T24肿瘤细胞增殖作用 MTT结果发现JAK抑制剂ADZ1480及大蒜素均能有效抑制T24肿瘤细胞的增殖，且每组细胞的增殖效果具有时间依从性；同时，研究也发现大蒜素3组抑制效果明显强于大蒜素1组和大蒜素2组，提示大蒜素的抑制作用具有剂量依从性效果。（表1）

表1 MTT法检测大蒜素对T24肿瘤细胞的增殖抑制作用（±s）

表1 MTT法检测大蒜素对T24肿瘤细胞的增殖抑制作用（±s）

与同组24 h相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与大蒜素1组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 n抑制率（%）24 h 36 h 48 h 72 h ADZ1480组 20 16.9±5.5## 29.2±7.4*## 36.5±6.8**## 41.2±9.9**##大蒜素1组 20 5.4±1.2 6.2±1.7 7.5±1.3* 9.0±2.1*大蒜素2组 20 9.6±2.3# 11.7±3.6*# 12.6±2.7**# 15.8±2.6**#大蒜素3组 20 18.1±3.8## 20.3±3.4*## 25.9±4.9**## 32.3±3.5**##

2.4 大蒜素抑制膀胱肿瘤细胞T24细胞JAK1/2/3蛋白表达 研究发现JAK抑制剂ADZ1480处理细胞后JAK信号通路关键蛋白JAK1、JAK2和JAK3的表达明显降低，且与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01），同时，大蒜素1组和2组的上述蛋白表达也明显降低，且具有剂量依从性效果（P＜0.05，P＜0.01）。（图3）

图3 Western blotting分析JAK1/2/3蛋白分子在不同药物处理膀胱癌肿瘤细胞中表达的差异性

2.5 大蒜素抑制膀胱肿瘤细胞T24细胞STAT1/3蛋白表达 研究发现JAK抑制剂ADZ1480处理细胞后JAK信号通路关键蛋白STAT1和STAT3的表达明显降低，且与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01），同时，大蒜素1组和2组的上述蛋白表达也明显降低，且具有剂量依从性效果（P＜0.05，P＜0.01）。（图4）

图4 Western blotting分析STAT1/2蛋白分子在不同药物处理膀胱癌肿瘤细胞中表达的差异性

2.6 大蒜素抑制膀胱肿瘤细胞T24细胞MMPs蛋白表达 研究发现JAK抑制剂ADZ1480处理细胞后基质金属蛋白酶家族MMP2、MMP9和MMP12的表达明显降低，且与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01），同时，大蒜素1组和2组的上述基质金属蛋白酶表达也明显降低，且具有剂量依从性效果（P＜0.05，P＜0.01）。（图5）

图5 Western blotting分析MMP2、MMP9和MMP12蛋白分子在不同药物处理膀胱癌肿瘤细胞中表达的差异性

2.7 大蒜素抑制膀胱肿瘤细胞T24细胞TIMPs蛋白表达 研究发现JAK抑制剂ADZ1480处理细胞后基质金属蛋白酶家族抑制剂TIMP1和TIMP2的表达明显降低，且与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01），同时，大蒜素1组和2组的上述蛋白表达也明显降低，且具有剂量依从性效果（P＜0.05，P＜0.01）。（图6）

图6 Western blotting分析TIMP1及TIMP2蛋白分子在不同药物处理膀胱癌肿瘤细胞中表达的差异性

3 讨论

膀胱癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，严重影响患者的生存状态和生活质量。但是，目前关于膀胱癌的确切的发病机制尚不明确，临床上也缺乏有效的治疗药物。因此，探究其发病机制及相应的治疗药物，具有重要的理论和现实意义。本研究在探讨膀胱肿瘤细胞T24凋亡的JAK/STAT3通路参与作用及大蒜素促进细胞凋亡的相关机制的研究中发现JAK抑制剂ADZ1480及大蒜素均能有效抑制T24肿瘤细胞的增殖，且抑制效果具有时间和剂量依从性；药物处理后细胞凋亡蛋白Bax及Caspase 3和Caspase 9表达升高而Bcl2表达降低，JAK通路蛋白JAK1、JAK2、JAK3和STAT1及STAT3表达升高，基质金属蛋白酶MMP2、MMP9和MMP12及其抑制剂TIMP1和TIMP2表达明显升高，也具有剂量依从性效果。因此，大蒜素能够有效抑制膀胱肿瘤细胞T24增殖、促进其凋亡，其可能是通过抑制肿瘤细胞中过度激活的JAK/STAT通路实现的。

细胞增殖抑制和细胞凋亡是抗肿瘤药物发挥药理作用的主要机制，也是临床上进行药物治疗恶性肿瘤的重要思路。细胞凋亡是细胞内普遍存在的生理性过程，是细胞的程序化死亡过程。细胞凋亡是由一系列细胞凋亡蛋白介导的，如Bax/Bcl2蛋白、Caspase蛋白家族、C-Myc等。在研究丁酸钠诱导肿瘤细胞凋亡过程中的作用机制的论述中认为抑癌基因p14、p16及p21和C-Myc信号通路共同参与了肿瘤细胞的凋亡过程[11]。在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体抑制卵巢癌3AO细胞凋亡的研究中发现凋亡诱导配体可以通过抑制细胞增殖周期、激活细胞凋亡蛋白Caspase 3表达发挥促进卵巢癌细胞凋亡的作用[12]。在分析PKC412联合阿霉素对大鼠膀胱肿瘤生长及细胞凋亡影响的研究中也证实二者联用促进细胞凋亡的效果明显优于单独使用，且此过程中伴随微血管密度的降低和CD31表达的下调[13]。陶锋等[14]研究也发现耳叶牛皮消苷A代谢产物具有明显的抗肿瘤活性及诱导肿瘤细胞凋亡的作用，且其主要作用机制是诱导肿瘤细胞处于G2M期。本研究也发现JAK抑制剂ADZ1480处理细胞后细胞凋亡蛋白Bax及Caspase 3和Caspase 9的表达明显升高，而抑制凋亡蛋白Bcl2表达明显降低，且与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01），同时，大蒜素1组和2组的上述细胞凋亡蛋白表达也明显变化，且具有剂量依从性效果，表明Bax/Bcl2及Caspase家族介导的细胞凋亡过程是大蒜素促进T24细胞凋亡的主要机制。同时，在研究白芥子挥发油对小鼠肝癌H22移植性肿瘤的抑制作用时也证实Bax/Bcl2蛋白是引起细胞凋亡的主要因子[15]。

JAK/STAT信号转导通路参与了多种疾病的发生及发展过程，且与多种肿瘤的生理过程密切相关[16]。在研究舒尼替尼抑制头颈鳞癌细胞PCI-13增殖的研究中证实药物主要通过阻断STAT3信号转导通路发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用[17]。在分析瘦素激活肿瘤相关巨噬细胞促进乳腺癌细胞MCF7的迁移及侵袭的研究中也发现JAK信号通路参与了此过程[18]。与以往报道一致，本研究也发现JAK抑制剂ADZ1480处理细胞后JAK信号通路关键蛋白JAK1、JAK2和JAK3及STAT1和STAT3的表达明显降低，且与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01），同时，大蒜素1组和2组的上述蛋白表达也明显降低，且具有剂量依从性效果，表明药物主要通过抑制JAK/STAT3信号通路发挥促细胞凋亡的作用。

因此，大蒜素能够有效抑制膀胱肿瘤细胞T24增殖、促进其凋亡，其可能是通过抑制肿瘤细胞中过度激活的JAK/STAT通路实现的。