猪骨骼肌内参基因的筛选及验证

华永琳，张小玉，曹海港，杨公社，史新娥

（西北农林科技大学动物科技学院，动物脂肪沉积与肌肉发育实验室，陕西杨凌 712100）

随着生活水平的不断提高，人们对肉品质的需求也逐步提升。关中黑猪是陕西省地方优良猪种资源，主要分布在咸阳、周至、杨凌等地区，因肉质细嫩、大理石纹明显及口感佳而备受青睐。决定肉品质的因素有遗传因素、环境因素、营养因素与管理因素等，其中肌纤维类型和肌内脂肪含量是影响肉质的关键。根据其肌球蛋白重链（Myosin Heavy chain，）亚型不同，肌纤维类型可分为型、型、型和型。其中猪背最长肌（Longissimus Dorsi，LD）以型为主，而比目鱼肌（Soleus,Sol）以型为主。为研究不同肌纤维类型与肉品质的关系及其调控机理，需要检测背最长肌（LD）和比目鱼肌（Sol）中肌纤维相关基因的表达情况。

实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative System，RTqPCR）是现代分子实验中分析基因表达的重要工具，其中内参基因的正确选择是RT-qPCR 相对定量的重点。近年来的研究表明，不同品种、不同类型的肌肉组织以及不同时期的肌肉组织中内参基因的表达具有较大差异。如McBryan 等人发现在不同遗传背景的猪胸肌和腰肌中2-微球蛋白（Beta-2-Microglobulin，是表达最稳定的内参基因，而Niu 等人却表示在长白猪背最长肌中并不是最佳内参基因。此外，Meng 等人的研究也表明内参基因的选择对于目的基因的准确表达具有决定性作用。

因此，本研究以不同日龄、不同性别关中黑猪的LD 和Sol 为实验材料，通过RT-qPCR 方法及geNorm和NormFinder 软件筛选3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glycer aldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，）、-肌动蛋白（-actin，）、肽基脯氨酰异构酶A（Peptidylprolyl Isomerase A，）、TATA 盒结合蛋白（TATA Box-binding Protein Tyrosine，）、2-微球蛋白（Beta-2-microglobulin，）、酪氨酸3-单加氧酶/ 色氨酸5 单加氧酶活化蛋白（Tyrosine 3-monooxygenase/Tryptophan 5-monooxygenase Activation Protein，Zeta Polypeptide，）、真核延伸因子1样蛋白（Eukaryotic Elongation Factor-1，）和18s 小亚基单位核糖体核酸（18S Ribosomal RNA，）8 个候选内参基因中表达最稳定的内参基因，并以为目的基因进行验证，以期为关中黑猪骨骼肌纤维类型的相关研究提供基础，也为进一步研究骨骼肌发育不同阶段的基因表达分析提供有价值的信息。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验所用组织来自于24 头关中黑猪。其中3、30、90 d 和180 d 的阉割公猪及母猪各3 头，采集背最长肌和比目鱼肌，置于-80℃低温冰箱保存，用于提取总RNA。

1.2 总RNA 的提取及cDNA 的合成 使用TRIZOL（TaKaRa，中国大连）试剂从采集的背最长肌和比目鱼肌中提取总RNA。RNA 的质量和浓度通过核酸浓度测定仪（Bio-Rad）进行评估，其中将OD/OD在1.8～2.0 的样品按照PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa，中国大连）试剂盒进行反转录，合成的cDNA 保存于-80℃低温冰箱备用。

1.3 引物设计 本研究选取和等8 个 候选内参基因。设计8 个候选基因的特异性引物（表1），由Invitrogen 公司（上海）合成。

表1 候选内参基因的引物序列

1.4 实时荧光定量PCR RT-qPCR 的反应体系是10 μL：荧光染料SYBR Green Mix 5 μL，Forward Primer和Reverse Primer 各0.3 μL（终浓度150 nmol/L），RNase Free ddHO 3.4 μL，cDNA(100 ng/μL)1 μL。实时荧光定量PCR 反应条件如表2 所示。反应后根据熔解曲线分析PCR 产物的特异性，分别导出目的基因和内参基因的Ct 值。

表2 Real time-qPCR 操作过程

1.5 数据分析 采用geNorm 和NormFinder 对候选基因的表达稳定性进行分析。其中geNorm 通过基因的相对表达水平（2）计算候选内参基因的稳定性（M 值），M 值越小，内参基因的表达水平越稳定；反之，M 值越大，内参基因的表达越不稳定。NormFinder 的原理和geNorm 相似，根据内参基因的稳定值大小来筛选最适的内参基因。

2 结果与分析

2.1 内参基因引物的特异性及Ct 值变化 对等8 个候选内参基因的引物进行扩增，RT-qPCR 熔解曲线均表现为单个产物的峰值，即为特异性扩增。通过梯度稀释猪骨骼肌cDNA 样品后进行PCR 扩增，绘制8 个候选内参基因的标准曲线，计算结果显示扩增效率E 在0.89～1.12，说明内参基因的引物特异性较好，可用于后续分析。此外，qPCR 检测内参基因在猪骨骼肌中的循环阈值（Ct）的变化，结果显示基因的Ct 值变化差异最大，即ΔCt 为4.32，而基因的Ct 值变化差异最小，ΔCt 为2.08（图1）。

图1 8 个候选内参基因在猪骨骼肌中的Ct 值变化

2.2 内参基因在不同日龄和不同性别的背最长肌（LD）及比目鱼肌（Sol）中的表达稳定性 本实验利用geNorm 和NormFinder 软件进行分析，选择出不同实验条件下最佳的内参基因。对关中黑猪不同日龄及不同性别的LD 中稳定内参基因的geNorm 分析结果显示：8 个候选内参基因在不同样品中的表达稳定性存在较大差异。其稳定性排序依次为>>>>>>，其中在关中黑猪不同日龄样品中最稳定（M=1.437），最不稳定（M=2.434）；而在关中黑猪不同性别样品中最稳定（M=1.075），其次是和，最不稳定，M 值达到3.203（图2）。

图2 内参基因在不同日龄和不同性别背最长肌中的表达稳定性

对关中黑猪不同日龄及不同性别的比目鱼肌稳定内参基因的geNorm 分析结果显示：在关中黑猪不同日龄的样品中，内参基因稳定性依次为：>，其中的M 值最小（M=1.084），其次是（图3A）；而在关中黑猪不同性别样品中，稳定性排序为===，其中和的M 值最小（M=0.723），其次是和（图3B）。

图3 内参基因在不同日龄和不同性别比目鱼肌中的表达稳定性

通过NormFinder 软件分析关中黑猪不同日龄及不同性别的背最长肌中稳定表达的内参基因，结果显示：在不同日龄的样品中，候选内参基因的稳定值（S 值）最小（S=0.355），表明其表达最稳定，其次为和；而在不同性别样品中，和的表达最稳定（S=0.048），表达最不稳定，S 值高达2.181（表3）。

表3 利用NormFinder 软件分析不同实验中8 个候选内参基因在背最长肌中的表达稳定性

在关中黑猪不同日龄及不同性别的比目鱼肌中，NormFinder 分析候选内参基因的稳定性，结果如表4 所示。在不同日龄的样品中，候选内参基因的S 值最小（S=0.257），表明其稳定性最高，其次为和；而在不同性别样品中，和的表达稳定性最高（S=0.335），最不稳定的是和基因。

表4 利用NormFinder 软件分析不同实验中8 个候选内参基因在比目鱼肌中的表达稳定性

2.3 内参基因稳定性的验证 为进一步验证内参基因的稳定性，以不同候选基因作为内参基因，检测背最长肌和比目鱼肌中的表达。另外，对以上筛选出的3 个较稳定基因（）进行两两混合检测的表达。图4 结果表明和3 个候选基因中的稳定性相对于和较好。和一起作为内参基因、和作为内参基因、和作为内参基因、单独作为内参基因检测在背最长肌和比目鱼肌的相对表达量发现，在2 种不同类型肌肉中并无差异，和单独作为内参基因对进行校正，显示在背最长肌和比目鱼肌中表达存在显著差异。因此可作为关中黑猪不同类型骨骼肌中稳定表达的内参基因。

图4 以不同候选基因作为内参分析不同肌纤维类型MyHC IIx 的表达

3 讨 论

理想的内参基因应该在不同条件下都能稳定表达，但目前为止，任何一种内参基因只在特定实验条件下稳定表达，在不同的发育阶段、细胞、组织、器官、个体以及不同的实验条件下，内参基因的稳定性存在显著差异。目前的研究表明，采用多个内参基因对目的基因进行校正相对于单个内参基因要更加准确。

本研究通过geNorm 和NormFinder 软件分析得出和基因在关中黑猪4 个不同日龄和2 种性别条件下的背最长肌和比目鱼肌中表达较稳定，进一步验证后发现相对其余2 个内参基因更稳定，可将其作为关中黑猪骨骼肌中稳定表达的内参基因。Erkens 等在筛选猪的背膘和背最长肌中稳定表达的内参基因时也发现和分别是猪背膘和背最长肌中表达最稳定的内参基因，这与本实验研究结果相一致。而Niu 等在筛选长白猪不同发育阶段的背最长肌中稳定表达的内参基因时发现，和是背最长肌中表达最稳定的内参基因，而和在候选内参基因中具有最大的变异性。该结果与本研究中得出的结果有偏差，其中一个原因可能是实验采集的样本存在差异。另一方面，和可能更适用于不同的猪组织类型，而不是不同的猪骨骼肌发育阶段。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（）因其在各个组织中高表达且蛋白表达量恒定而被认为是“经典管家基因”。有研究显示，在肿瘤及衰老的骨骼肌中表达下降，因此适合作为骨骼肌中稳定表达的内参基因。此外，冯小婷的研究结果也显示不适合作为大白猪和梅山猪骨骼肌的内参基因。而Gu 等发现是荣昌猪脂肪组织中的最佳内参基因，是肌肉组织中稳定表达的内参基因。同样，陈利等在南江黄羊母羊不同发育时期的骨骼肌中筛选出的稳定内参基因也是。这与本实验研究结果相似，即在关中黑猪的不同发育阶段的骨骼肌中可将作为内参基因。以上结果表明在特定的实验条件下，研究人员需根据自身实验要求来选择合适的内参基因，以免得出错误的结论。

4 结 论

综上所述，本实验成功筛选出在关中黑猪的不同发育阶段、不同性别的骨骼肌中稳定表达的内参基因为，并以此为内参基因来校正目的基因的表达，为后续猪骨骼肌相关类型的研究中准确定量目的基因的mRNA 表达提供了可靠的依据。