高效液相色谱法同时测定复方硫酸新霉素滴眼液中3种成分含量

赵 猛，李 玲

（江苏省连云港市食品药品检验检测中心，江苏 连云港 222000）

复方硫酸新霉素滴眼液的主要适应证为急、慢性结膜炎、角膜炎、巩膜炎、葡萄膜炎、急性巩膜炎、白内障、青光眼、角膜移植术后，以及眼部机械性损伤或化学烧伤处理等，主成分包括硫酸新霉素、地塞米松磷酸钠、肌苷等，处方中还加入了抑菌剂，以延长药品保质期。其现行质量标准含量测定仅以硫酸新霉素和地塞米松磷酸钠为指标成分，且后者的测定方法为异烟肼比色法［1］，操作较烦琐，杂质干扰大；而对于抑菌剂类成分含量的控制，标准中也未涉及。本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定复方硫酸新霉素滴眼液中肌苷、羟苯乙酯和地塞米松磷酸钠3种成分的含量［2-5］。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪，包括Waters 2998 PDA检测器和Empower色谱工作站（美国Waters公司）；BP211D型电子分析天平（德国Sartorius公司，精度为十万分之一）；KH-700DE型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，功率为700W，频率为40kHz）。

1.2 试药

复方硫酸新霉素滴眼液（武汉五景药业有限公司，批号分别为18080106，18120104，19040113）；肌苷对照品（批号为140669-201606，含量为98.6%），羟苯乙酯对照品（批号为100847-201604，含量为99.9%），地塞米松磷酸酯对照品（批号为101116-201803，含量为99.1%），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，磷酸、三乙胺为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex GeminiC18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：1%三乙胺溶液［用磷酸调pH至（3.0±0.05），A］-甲醇（B），梯度洗脱（0～6 min时80%A，6～8 min时80%A→50%A，8～30 min时50%A）；流速：1.0 mL／min；检测波长：248 nm；柱温：25℃；进样量：50μL。

2.2 溶液制备

取肌苷、羟苯乙酯和地塞米松磷酸酯对照品各适量，精密称定，置同一容量瓶中，加流动相制成质量浓度分别为1 009.7，417.4，1 004.4μg／mL的混合对照品贮备溶液（地塞米松磷酸酯质量折算为地塞米松磷酸钠质量）；精密移取1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加流动相定容，摇匀，即得混合对照品溶液。精密量取样品1 mL，置10 mL容量瓶中，加流动相定容，摇匀，即得供试品溶液。按复方硫酸新霉素滴眼液处方和工艺制备缺肌苷、羟苯乙酯和地塞米松磷酸钠的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下3种溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。结果阴性对照品溶液色谱中，在与肌苷、羟苯乙酯和地塞米松磷酸酯对照品溶液色谱相同保留时间处无干扰峰，表明方法专属性良好。

线性关系考察：分别精密量取2.2项下混合对照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，置20 mL容量瓶中，加流动相定容，摇匀，制成系列混合对照品溶液。精密量取上述系列对照品溶液各50μL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以肌苷、羟苯乙酯和地塞米松磷酸钠进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y1＝1.313 6×105X1-5.926 7×104（r1＝0.999 7），Y2＝2.277 8×105X2-7.274 6×104（r2＝0.999 5），Y3＝7.160 3×104X3-7.971 5×104（r3＝0.999 5）。结果表明，肌苷、羟苯乙酯和地塞米松磷酸 钠 进 样 量 在2.525～7.575μg、1.055～3.160μg、2.510～7.535μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果肌苷、羟苯乙酯和地塞米松磷酸钠峰面积的RSD分别为0.29%，0.33%，0.44%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，8，12，24 h，按2.1项下色谱条件进样测定。结果肌苷、羟苯乙酯和地塞米松磷酸钠峰面积的RSD分别为0.57%，0.46%，0.42%（n＝6），表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验：精密称取样品（批号为18080106）1mL，各6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果肌苷、羟苯乙酯和地塞米松磷酸钠平均含量分别为937，283，982μg／mL，RSD分别为0.68%，0.94%，0.51%（n＝6），表明方法重复性良好。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

表1 加样回收试验结果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n＝6）

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为18080106）适量，共6份，分别加入一定质量浓度的对照品溶液，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

取3批样品各适量，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积，计算样品含量，并与原标准方法测得的地塞米松磷酸钠含量进行比较。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（μg／mL，n＝3）Tab.2 Content determination of three constituents in the samples（μg／mL，n＝3）

3 讨论

预试验中，参考文献［6-8］，分别考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-1%三乙胺溶液为流动相时等度洗脱和梯度洗脱对测定结果的影响。结果表明，采用甲醇-1%三乙胺溶液梯度洗脱体系，基线平稳，各峰出峰时间适宜，且分离度较好，因此最终选择甲醇-1%三乙胺溶液作为流动相，并优化梯度洗脱程序。同时，考察了检测波长分别为240，243，248，253 nm时的色谱图，结果以248 nm为检测波长时，各峰吸收强度适宜，分离度好。

眼用制剂中的抑菌剂是导致眼部不良反应的重要因素［9-10］，长期使用该类眼用制剂可能损害眼部健康，因此控制眼用制剂中抑菌剂的含量对于减少用药风险具有重要意义。本研究中采用HPLC法对地塞米松磷酸钠含量进行测定，与原标准中异烟肼比色法测定的地塞米松磷酸钠含量相比，结果准确度相当，且增加了对肌苷和抑菌剂羟苯乙酯的含量测定，方法简便，其他组分干扰小，精密度、重复性、回收率均良好，可用于复方硫酸新霉素滴眼液的质量控制。