miR-10a、miR-21联合预测老年重症脓毒症患者的病死率

严宪才 吴志光 刘锦文 周耀辉 刘俊锋 陈子良 （中山市中医院急诊科，中山528400）

脓毒症是指有明确感染的全身炎症反应综合征，发病率较高，且以每年1.5%～8.0%的速度增长，病死率在37.4%～46.5%［1］。重症脓毒症表现为伴有器官功能障碍和/或组织灌注不足，若病情短期内得不到有效逆转，患者最终会因多脏器功能障碍死亡［2］。老年人机体功能退化，免疫力降低，抵御疾病能力较弱，老年重度脓毒病患者28 d病死率相对较高［3］。因此寻找预测老年重度脓毒病患者28 d病死风险的生物标志物，提前调整治疗方案，对降低患者病死率意义重大。微小RNA（microRNA，miRNA）已被证实与人体组织的代谢、炎症反应以及脓毒症的发生发展有着不可分割的联系［4］。微小RNA-10a（microRNA-10a，miR-10a）作为miRNA中的重要类型，参与炎症、免疫应答反应等多种生物学过程［5］。微小RNA-21（microRNA-21，miR-21）据报道是一种抗凋亡因子，与脓毒症的急性肾损伤有关，影响患者生存期［6］。但miR-10a、miR-21在28 d病死与生存的老年重症脓毒症患者中的表达差异和其预测价值尚不清楚，因此本研究通过对比研究老年重症脓毒症患者外周血miR-10a、miR-21水平与老年重症脓毒症患者28 d病死率之间的关系，探究二者联合对老年重症脓毒症患者28 d病死率的预测效能。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 回顾分析2017年6月至2019年10月于本院接受治疗的102例老年重症脓毒症患者的临床资料，其中男性55例，女性47例，年龄60～78岁，平均年龄（63.12±11.04）岁，身体质量指数（body mass index，BMI）15.26～27.65 kg/m2，平 均BMI（21.66±3.85）kg/m2。治疗措施：血管活性物质干预24例，体外肺膜支持20例，连续性血液净化35例，机械通气辅助通气27例，使用糖皮质激素19例。原发感染部位：肺或呼吸道感染20例，泌尿系统感染26例，腹腔感染10例，中枢系统感染9例，血液感染25例，外科伤口感染5例，胆道感染7例。合并症：合并糖尿病15例，高血压24例，心肌损伤10例，烧伤4例，肝损伤10例，其中合并2项及以上7例。

1.1.2 纳入标准 ①具有明确的感染，临床症状和化验结果均符合脓毒症的诊断标准［7］；②合并出现器官功能障碍如：严重急性呼吸综合征（acute re‐spiratory distress syndrome，ARDS）、心功能不全、应激性溃疡、急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）、肝功能不全等；③年龄≥60岁；④临床资料完整并同意调阅研究。

1.1.3 排除标准 ①处于濒死状态；②非细菌感染；③器官移植、非获得性免疫缺陷症、恶性肿瘤；④肝脏、肾脏、心脏疾病处于终末期；⑤妊娠或哺乳。

1.2 方法

1.2.1 分组 患者确诊后28 d内是否死亡为标准，将102例纳入标准的研究对象分为2组，其中确诊后28 d内死亡患者为死亡组，确诊后28 d未发生死亡的患者为生存组。

1.2.2 检测外周血miR-10a、miR-21 所有患者于入院当天采取清晨空腹外周静脉血6 ml置于含有肝素无菌抗凝管（20 U/ml），密度梯度离心法分离外周血中单个核细胞，使用RNA提取试剂盒提取外周血单个核细胞中总RNA，利用UV-5800H型紫外分光光度计检测总RNA纯度，采用逆转录试剂盒将总RNA转录为模板链cDNA。采用CFX96型荧光定量PCR仪进行qRT-PCR，反应体系共10μl：miS‐cript SYBR®Green Mix 5μl，cDNA（50 ng/μl）1μl，上下游引物（10μmo/lL）各0.5μl，ddH2O 3.0μl。反应条件：95℃90 s，95℃30 s，63℃30 s，72℃15 s，45个循环，每个样品均设3个平行反应。采用2-∆∆Ct法对血清miR-10a、miR-21表达水平进行定量分析。miR-10a、miR-21及内参U6的引物序列见表1。

1.2.3 影响老年重症脓毒症患者28 d病死率的危险因素分析 将所有可能影响老人重症脓毒症患者确诊后28 d内死亡的影响因素归纳整理：性别、BMI、C反应蛋白（C-reaction protein，CRP）、血清乳酸、急性生理学和慢性健康状况评分系统Ⅱ评分［8］（acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ）、维生素D（vitamin，VitD）、治疗措施、原发病、合并症、miR-10a、miR-21，将其作为自变量（X）并赋值，赋值结果见表2，确诊后28 d内发生死亡记为1，未发生死亡记为0，分析影响老年重症脓毒症患者28 d病死率的危险因素。

1.2.4 观察指标 ①分析影响老年重症脓毒症患者28 d内死亡的影响因素及比值比（OR）；②评估miR-10a、miR-21对老年重症脓毒症患者28 d内死亡的预测价值。

1.3 统计学方法 采用统计学软件SPSS20.0进行数据分析，计数资料采用“例/率”表示，行χ2检验，若理论频数在1～5之间，采用校正χ2检验；计量资料采用±s表示，行t检验；Logistic回归分析影响老年重症脓毒症患者28 d病死的危险因素；Pearson法分析患者APACHEⅡ评分与外周血miR-10a和miR-21的相关性；受试者工作特征ROC曲线评估外周血miR-10a和miR-21表达水平预测老年重症脓毒症患者28 d病死率的效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组患者外周血miR-10a、miR-21表达水平比较 所有研究对象确诊后28 d内死亡患者29例（死亡组），存活患者73例（存活组），28 d病死率为28.43%。入院时死亡组外周血miR-10a、miR-21表达水平显著高于存活组（P＜0.05），见表3。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

表2 老年重症脓毒症患者28 d病死率自变量赋值表Tab.2 Independent variable assignment of mortality rate in 28 d in elderly patients with severe sepsis

表3 2组外周血miR-10a、miR-21表达水平比较（xˉ±s）Tab.3 Comparison of expression levels of miR-10a and miR-21 in peripheral blood between two groups（xˉ ±s）

2.2 2 组不同临床特征患者28 d死亡率对比 死亡组APACHEⅡ评分≥20分患者构成比显著高于存活组（P＜0.05），2组患者在CRP、血清乳酸、VitD水平和外周血miR-10a、miR-21表达水平分布上有差异（P＜0.05），其中死亡组CRP≥40 mg/L、血清乳酸≥3 mmo/lL、VitD＜20 ng/ml、miR-10a表达水平≥1.31、miR-21表达水平≥2.39者构成比显著高于存活组（P＜0.05），见表4。

2.3 Logistic回归分析 经过Logistic回归分析可知，APACHEⅡ评分≥20分、CRP≥40 mg/ml、血清乳酸≥3 mmo/lL、外周血miR-10a表达水平≥1.31、外周血miR-21表达水平≥2.39是老年重症脓毒症患者28 d病 死 的 独 立 危 险 因 素（OR=5.842、4.328、3.554、1.645、4.031），VitD＞26 ng/ml是老年重症脓毒症28 d病死的保护因素（OR=0.321），见表5。

2.4 APACHEⅡ评分与外周血miR-10a、miR-21的相关性分析 Pearson分析发现，APACHEⅡ评分与外周血miR-10a、miR-21无相关性（r=0.317、0.309，P=0.085、0.142）。

2.5 miR-10a、miR-21及联合对老年重症脓毒症患者28 d死亡率的预测价值 根据外周血miR-10a、miR-21表达水平及二者联合预测老年重症脓毒症患者28 d病死率的ROC曲线（图1）可知，外周血miR-10a、miR-21表达水平的最佳截断点为1.68、1.81，灵敏度分别为93.10%、82.75%、96.55%，特异度分别为73.97%、84.93%、90.41%，AUC分别为0.863、0.893、0.920，见表6。

表4 2组不同临床特征患者28 d死亡率对比[n,(%）]Tab.4 Comparison of 28 d mortality of patients with different clinical characteristicsin group 2[n,(%）]

表5 Logistic回归分析Tab.5 Logistic regression analysis

表6 miR-10a、miR-21及联合对老年重症脓毒症患者28 d死亡率的预测价值Tab.6 Predictive value of miR-10a，miR-21 and their combination on 28 d mortality in elderly patients with severe sepsis

图1 miR-10a、miR-21及联合预测ROC曲线Fig.1 Curve of miR-10a，miR-21 and combination pre⁃diction ROC

3 讨论

miRNA在人体中的表达异常可引起某些疾病的发生和发展［11-12］。miRNA不仅与肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡有关，还参与异常的机体免疫应答和炎症反应过程［13］。脓毒症是由感染引起的全身性炎症反应，严重时患者器官发生衰竭，病情凶险，死亡率高，因此迫切需要生物标志物预测老年重症脓毒症患者28 d病死率，协助判断预后。既往研究证明，miR-21与脓毒症的发病和进展相关，但是有关miR-10a在脓毒症患者中的表达研究鲜有，同时二者与老年重症脓毒症患者28 d死亡率之间的关系尚未阐明，是否可以作为预测其预后的标志物，是一项值得探讨的课题［14］。

本研究发现，患者28 d病死率为28.43%，入院时死亡组外周血miR-10a、miR-21表达水平显著高于存活组，说明外周血miR-10a、miR-21的高表达与老年重症脓毒症28 d病死率有关，外周血miR-10a、miR-21表达水平影响患者病情发展。霍锐等［9］研究发现，脓毒症所致肾损伤患者28 d病死率为35.53%，本研究与之有一定差距，可能由于本研究所选研究对象高龄、发展到严重时期时已确诊为脓毒症的原因使其成为重点防护对象，治疗更确切，从而病并且还发现死亡患者血清中miR-10a-5p表达水平升高，本研究与之一致，说明外周血中miR-10a水平对脓毒症患者28 d病死率影响较大。WANG等［15］发现脓毒症患者体内miR-21表达升高，且经过体外细胞培养发现miR-21升高直接加重肾小球的滤过屏障功能的损伤，说明miR-21的高表达可能与脓毒症患者的病情有关。

本研究中经Logistic回归分析发现，外周血miR-10a表达水平≥1.31、外周血miR-21表达水平≥2.39、APACHEⅡ 评分≥20分、CRP≥40 mg/ml、血清乳酸≥3 mmo/lL是老年重症脓毒症患者28 d病死的独立危险因素，VitD＞26 ng/ml是老年重症脓毒症28 d病死的保护因素。研究报道［16］，APACHEⅡ评分是脓毒症患者28 d死亡的独立危险因素，APACHEⅡ评分≥19.5分的脓毒症患者，28 d病死率显著上升，说明病情越严重患者死亡风险越高，需在患者入院治疗时及时进行APACHEⅡ评分，根据其是否存在高病死风险，及时采取有效干预措施。同时，临床上高龄（一般认为≥70岁）患者通常合并基础病较多，多器官功能障碍，免疫力低下，患病期间的病死率也相应上升，因此年龄≥70岁的患者应注意全面治疗，避免手术干预［17］。CRP可以避免淋巴细胞过度活化，代偿性降低炎症反应对机体的损伤，CRP含量升高，表明机体炎症反应较高［18］。覃小兰等［19］研究报道，CRP是老年肺部感染致脓毒症患者28 d死亡的危险因素，提示应及时观测CRP水平，做好防治工作。据报道［20］，感染风险增加与VitD缺乏有关，VitD可作用于T细胞抑制由Th17介导的炎症反应，提高重症脓毒症患者25（OH）D3的利用度，减轻炎症反应，降低死亡风险。陈隆旺等［21］研究发现，脓毒症致病过程中miR-10a表达上调，抑制miR-10a的表达可以显著提高调节T细胞的比例，促进免疫功能，说明异常升高的miR-10a可能通过抑制机体免疫功能加快脓毒症病情的发展，导致患者病死率上升。miR-21对人体有免疫调控功能，miR-21过表达会抑制TLR4信号通路，抑制机体免疫功能甚至免疫麻痹，最终导致患者死亡，提示外周血miR-21的过表达可能是导致老年重症脓毒症患者28 d病死率升高的原因［22］。

另外，本研究中APACHEⅡ评分与外周血miR-10a、miR-21无相关性，证实相互独立。外周血miR-10a、miR-21联合预测老年重症脓毒症患者28 d病死率的特异度、AUC均高于单独预测，且灵敏度与单独预测相近，提示二者联合预测老年重症脓毒症患者28 d病死率的价值更高。综上所述，确诊后28 d病死的老年重症脓毒症患者外周血miR-10a、miR-21表达水平异常升高，与老年重症脓毒症患者28 d病死率有关，APACHEⅡ评分≥20分、CRP≥40 mg/ml、血清乳酸≥3mmo/lL、外周血miR-10a表达水平≥1.68、外周血miR-21表达水平≥1.81的老年重症脓毒症患者28 d病死风险增加，VitD≥26 ng/ml老年重症脓毒症患者28 d病死风险降低，miR-10a联合miR-21用于预测老年重症脓毒症患者28 d病死率的效果较好，可作为预测其28 d病死率的有效标志物。