斑马鱼PKR剪接异构体克隆、鉴定及转录表达分析①

欧湘滢 邵 敏 高宗泽 代卫凯 熊嘉鸿 胡有生

（井冈山大学医学部，吉安343009）

非特异免疫是脊椎动物抵抗病毒侵入的第一道防线，干扰素系统则是机体非特异免疫抵抗感染和清除病毒的主要功能分子体系，而斑马鱼PKR（zebrafish double-stranded RNA-dependent protein ki‐nase，ZPKR）是干扰素系统抗病毒作用的主要效应分子［1-6］。PKR可识别和结合病毒的双链RNA，然后通过二聚化和自磷酸化激活其自身的蛋白激酶活性［4-5，7-9］。活化的PKR能够磷酸化真核细胞翻译起始因子2α（eIF2α），从而使其失去蛋白翻译起始活性，导致蛋白翻译起始的失败，引起蛋白翻译的抑制［5，7-11］。PKR一方面能抑制病毒RNA的复制，另一方面能抑制病毒和宿主细胞蛋白质的合成。最终导致病毒繁殖的抑制和感染病毒细胞的凋亡，并引起机体抗病毒免疫反应，限制病毒在体内的扩散［8-11］。近年来，有研究认为PKR还能在某些病理条件下激活炎性体，并且认为，PKR可能与过度营养导致的肥胖、高血压和糖尿病等密切相关，但其分子机制并不清楚［12-17］。

PKR分子由N端的双链RNA结合结构域（dou‐ble-stranded RNA binding domain，dsRBD）和C端的激酶结构域（kinase domain，KD）串联而成［5，7，9，18］。PKR的dsRBD和KD通过一个链接区（Linker）连接起来。人类PKR的dsRBD和KD之间的链接区是一个非结构化的长度大约为80个氨基酸的序列［5，9，19］。不同物种的PKR的链接区长度具有一定差异［20］。定点删除这个链接区后，人的PKR活性发生一定的改变，它与RNA的协同结合更为有效，整体结构更为伸展，但结构域之间的相互作用却变得微弱［21］。完全删去链接区，PKR仍具有活性。有实验研究证实，完全删除PKR的N端，包括dsRBD和链接区，单独的KD仍然具有磷酸化eIF2α的作用，但是不能对双链RNA发生反应［22-23］。说明dsRBD和链接区主要是对KD活化起调节作用。

有研究发现，PKR的dsRBD能够与5′端三磷酸的单链RNA结合并引起PKR的活化，但其研究并没有排除这种结合是否有链接区的参与［24］。MAYO等［25］最新研究认为，PKR与单链RNA的结合是由于链接区有一段富含碱性氨基酸的Basic Region的作用。富含碱性氨基酸的区域带较多正电荷，能够与单链RNA带负电荷的磷酸基团结合，并由此促进KD的二聚化和活化。

本研究小组在斑马鱼胚胎组织中，不仅克隆了ROTHENBURG等［26］克隆到的含有3个dsRBM的ZPKR（AM421527.1），还克隆到了含有N端dsRBD和C端KD之间的链接区异常的ZPKR剪接异构体（zebrafish PKR transcript variant，ZPKRV）的mRNA（MH425504.1）。通过分析发现，其链接区缺失了28个氨基酸序列。而其缺失的28个氨基酸刚好包括了链接区的碱性氨基酸区域。在斑马鱼细胞内含有两种不同的PKR，它们仅仅在链接区的长度上具有差异，这是在所有动物中首次发现的。至于它们是否在斑马鱼抗病毒免疫反应中具有不同的功能，仍需进一步的研究证实。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 本研究使用的斑马鱼购买于中国科学院水生生物研究所斑马鱼资源中心，由本校江西省发改委重点实验室江西省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选工程实验室繁育。

1.1.2 主要试剂与仪器 Taq DNA聚合酶、Prime‐star DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶（Xho I和EcoR I）、DL2000 Marker购于TaKaRa公司；琼脂糖（Agarose）、无水乙醇、异丙醇、DEPC（焦碳酸二乙酯）均购于上海生工生物工程有限责任公司。RNA提取试剂盒和反转录试剂盒均购于TaKaRa公司。美国ABI公司PCR仪、美国Thermo公司微型高速离心机、上海博迅立式压力蒸汽灭菌器（XQ-LS-100G）、苏州净化超净工作台（SW-CJ-ED）、杭州奥盛三联多用途金属浴、上海天能EPS300电泳仪等。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 在NCBI数据库中检索ZPKR基因（GenBank序列号：AM421527.1）序列，通过NCBI的在线保守结构域搜索系统CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi），确定ZPKR的N端3个dsRBM和激酶结构域位置，根据ZPKR和ZPKRV（MH425504.1）序列及其差异设计ORF克隆引物和qPCR的引物，见表1。

1.2.2 提取P oly I：C刺激不同时间的斑马鱼组织总RNA 为了进一步研究ZPKR在抗病毒免疫反应中RNA表达水平的变化，本实验购买人工合成的dsRNA类似物Poly I：C模拟病毒RNA对斑马鱼进行刺激实验。斑马鱼被置于本实验室适应性饲养1周后进行实验（所选个体均为健康斑马鱼）。按500μg/100 g剂量腹部注射Poly I：C，每条斑马鱼称重约为0.5 g。使用浓度为1 mg/ml的Poly I：C，则斑马鱼注射的剂量为2.5μ/l条。选取注射后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h这5个时间段，随机选取2条为一组提取斑马鱼组织总RNA，并通过琼脂糖凝胶电泳检测。同时利用反转录试剂盒，进行反转录合成cDNA。

表1 本研究使用的引物序列表Tab.1 List of primer sequences used in this study

1.2.3 半定量检测Poly I：C刺激不同时间的ZPKR和ZPKRV转录表达 为了检测斑马鱼总RNA和cD‐NA质量，以及初步了解ZPKR和ZPKRV表达差异，cDNA被用作对β-actin、ZPKR与ZPKRV之和及ZPKR进行PCR检测。以反转录得到的cDNA作为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系：cDNA模板1.00μl、ddH2O18.25μl、buffer 2.50μl、dNTP2.00μl、上下游引物分别0.50μl、Taq DNA聚合酶0.25μl。qPCR扩增反应，反应条件为：95℃10 min，95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，72℃7 min，反应28个循环。其中ZPKR+ZPKRV用的引物对是ZPQF和ZPQR；ZPKR用的引物对是ZPQ2F和QZP2R；β-actin用的引物对是ZACTINF和ZACTINR。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色后对琼脂糖凝胶成像。

1.2.4 qPCR检测Poly I：C刺激不同时间的ZPKR和ZPKRV转录表达 为了进一步区分ZPKR和ZPKRV的表达差异，用qPCR对β-actin、ZPKR与ZPKRV之和及ZPKR进行检测。目的基因和β-actin基因的qPCR反应体系，总体积20μl：SYBR 10μl；定量引物（F+R）0.8μl；ddH2O7.2μl；cDNA模板2μl。每个cDNA样品做3个重复，同时每个cDNA样品做3个β-actin对照。制备两种预混液，一是目的基因的预混液，包括SYBR、ddH2O、目的基因定量的上游引物和下游引物；另一个是β-actin的预混液，包括SYBR、ddH2O、β-actin基因定量的上游引物和下游引物。

qPCR反应参数：95℃5 min，95℃20 s，55℃30 s，72℃30 s，72℃7 min，40个循环。用2-ΔΔCt方法计算检测基因相对β-actin的表达倍数，数据都以±s表示。分别计算出ZPKR+ZPKRV和ZPKR各时间的相对定量数据，再用ZPKR+ZPKRV的数据减去ZPKR的数据，可以得到ZPKRV的定量数据。定量引物对同1.2.3。

1.3 统计学分析 数据通过SPSS16.0统计分析，Poly I：C刺激后在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h的ZPKR和ZPKRV的表达是否存在差异，该定量数据采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZPKR和ZPKRV克隆和结构分析 根据ROTHENBURG克隆的ZPKR序列设计克隆其ORF的引物，用斑马鱼cDNA为模板，将扩增的片段构建到pET32a上，并转化大肠杆菌DH5α进行测序。测序分析得到了2个不同的ZPKR。其中ROTHEN‐BURG等［26］克隆的ZPKR的ORF全长2 049 bp，编码682个氨基酸残基，ZPKRV的ORF全长1 965 bp，编码654个氨基酸残基。ZPKRV比ZPKR的ORF短84 bp，相应的氨基酸序列则短28个氨基酸序列。通过将核苷酸序列翻译成氨基酸序列，并用SMART预测其二级结构，结果如图1所示。这两种斑马鱼PKR的N端的dsRBD都含有3个dsRBM，C端都有1个KD。两者的差异仅仅是N端和C端之间的链接区长度的差异。ZPKRV在其dsRBD和KD的链接区中，缺少了28个氨基酸序列（图1B）。图的横线位置为qPCR引物设计所对应位置。因此，用引物对ZPQF、ZPQR既可对ZPKR的片段进行扩增，又可对ZPKRV的片段进行扩增；而引物对ZPQ2F、QZP2R只能对ZPKR的片段进行扩增。

2.2 ZPKR和ZPKRV氨基酸序列比对图 通过对ZPKR和ZPKRV的氨基酸序列比对，发现两者除linker缺少28个氨基酸外，ZPKR与ZPKRV的序列完全一致。而这缺少的28个氨基酸序列，恰好正是碱性氨基酸的聚集区（图2）。

2.3 半定量检测Poly I：C刺激下ZPKR+ZPKRV和ZPKR在不同时期的转录表达差异 图3结果显示，斑马鱼在Poly I：C刺激后，ZPKR+ZPKRV和ZPKR的转录表达在12 h都会明显上调，其中ZPKR在刺激24 h又会下调，然后48 h又升高。说明在Poly I：C刺激过程中，ZPKR和ZPKRV的表达都发生了变化，但并不清楚ZPKRV的变化规律。

图1 ZPKR和ZPKRV结构示意图Fig.1 Schematic diagram of ZPKR and ZPKRV struc⁃tures

图2 ZPKR和ZPKRV的链接区氨基酸序列比对图Fig.2 Amino acid sequence alignment of linker of ZPKR and ZPKRV

图3 斑马鱼Poly I：C刺激后不同时段的ZPKR+ZPKRV、β-actin和ZPKR的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products of ZP⁃KR+ZPKRV，β-actin，and ZPKR at different time after Poly I：C stimulation to Zebrafish

图4 ZPKR和ZPKRV的qPCR分析Fig.4 Fluorescence qPCR analysisof ZPKR and ZPKRV

2.4 qPCR检测ZPKR与ZPKRV相对β-actin的表达 所有数据在Mastercycler ep realplex上分析（图4）。ZPKR在Poly I：C刺激的各时间段的表达趋势与半定量的琼脂糖电泳的一致，有2个上调过程：12 h时有第1个上调峰，然后24 h下调，再在48 h上调。ZPKRV表达总体远低于ZPKR，并且只有1个上调峰，在Poly I：C刺激后24 h到达峰值，然后48 h又下调。而且，ZPKRV上调的最高点正好是ZPKR第1次上调后往下调点，即刺激后的24 h。ZPKR和ZP‐KRV相对β-actin表达量的比值在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h分别是11.49、12.95、11.50、3.08、17.78，刺激后24 h比值最小，刺激后48 h比值最大。

2.5 ZPKR和ZPKRV的mRNA表达 经统计结果发现，ZPKRV在0 h和24 h的mRNA表达水平存在显著差异（P＜0.05），0 h的ZPKR分别与12 h、24 h和48 h的mRNA表达水平存在显著差异（P＜0.05），而24 h的ZPKRV和ZPKR的mRNA表达水平存在显著差异（P＜0.05）。

3 讨论

在斑马鱼基因组内，虽然同时存在等位基因ZPKRa（基因登录号：AM421526.1）和ZPKRb（基因登录号：AM421527.1），但两者的核苷酸序列相差很小，氨基酸序列则只有5个氨基酸的差异，且都不在关键的位点［26］。除此之外，本研究发现斑马鱼细胞内还同时存在ZPKR和ZPKRV（基因登录号：MH425504.1）两种不同结构的PKR的表达，ZPKRV仅仅在链接区缺失28个氨基酸残基，其中包含缺失链接区内的功能模体碱性区。

PKR可被多种内源性和外源性RNA激活［27-28］。PKR还可以和含有5′端不同修饰的RNA结合并被激活［29］。NALLAGATLA等［29］研究证实，含有5′三磷酸的有限结构化RNA能与PKR的dsRBD结合并激活PKR。MAYO等［25］研究证实，人PKR能结合单链RNA并被单链RNA激活，含有5′三磷酸的单链RNA能与人PKR的dsRBD及碱性区结合并活化PKR。并提出，含有有限结构化的RNA通过与PKR的dsRBD和碱性区发生二价结合，进而提高其结合亲和力，增强PKR的二聚化活化。因此，失去了链接区的碱性区的ZPKRV，可能失去单链RNA结合作用，从而失去与某些情况下产生的具有5′三磷酸帽结构的mRNA结合，避免了PKR的活化和eIF2α的磷酸化作用，从而促进mRNA的翻译，起到对蛋白翻译的促进作用［24-25，29］。

当斑马鱼细胞内同时表达ZPKR和ZPKRV时，ZPKR和ZPKRV可结合在同一RNA分子上，并发生异二聚化，导致显性的负效应［30］。由于ZPKR和ZP‐KRV的dsRBD是完全一样的，都可以结合RNA，但是它们的链接区长度不一样，不能使KD发生二聚化，从而不能使激酶活性激活，不能磷酸化eIF2α，不能抑制蛋白翻译。因此，当ZPKR和ZPKRV同时表达时，虽然总的PKR量表达上升，但导致总体PKR抑制蛋白翻译的作用降低，可以有效促进蛋白翻译过程。

用人工合成的Poly I：C刺激斑马鱼，ZPKR的转录表达在12 h内完成1次上调然后降低，然后在48 h又上调；而ZPKRV则只在Poly I：C刺激后24 h表达上调然后降低。因此推测，斑马鱼体内这2种PKR的转录表达，其翻译表达的产物将在刺激后24 h共存于细胞内，通过显性的负效应，可能减弱其PKR上调后对蛋白翻译的抑制作用［30-32］。事实上，qPCR结果显示，在Poly I：C刺激后的24 h，ZPKRV表达达到峰值，并且ZPKR和ZPKRV的比值最小，为3.08。这时两者的相互作用产生的显性负效应最大，对蛋白翻译抑制作用最小。斑马鱼体内与抗病毒免疫相关的细胞因子，包括PKR、白介素、趋化因子、肿瘤坏死因子以及多种类型的干扰素等，随后的翻译表达就会有效的提高，从而增强细胞的抗病毒免疫能力［33-34］。

ZPKR和ZPKRV蛋白的相互作用，可用免疫共沉淀方法来进行研究，但由于ZPKR和ZPKRV两者差异太小，并且差异区域为非结构化区域，要制备具有区分效果的单克隆抗体有难度。另外，在斑马鱼细胞系中以不同比例过表达ZPKR和ZPKRV，并且可检测到被ZPKR抑制的特定蛋白翻译水平，可以间接证实ZPKR和ZPKRV相互作用调控蛋白翻译的功能。以上实验都需要进一步研究证实。

本研究首次发现了ZPKRV，并且与ZPKR同时存在于斑马鱼体内。与ZPKR相比，ZPKRV仅在链接区缺失了与单链RNA结合作用相关的碱性区。进一步定量分析显示，ZPKRV可能通过失去与单链RNA的结合作用，与ZPKR异二聚化导致显性的负效应，从而增强抗病毒免疫相关蛋白的翻译。