点击化学在食品安全检测中的应用研究进展

谢桂芳，苏本超，谢晓霞，孙志昶，陈 奇，曹宏梅，刘 星

(海南大学 食品科学与工程学院，海南 海口 570228)

1 点击化学简介

点击化学(Click chemistry)由化学家Sharpless于2001年首次提出[1]，又叫“链接化学”、“速配接合组合化学”，是一种新型合成方法，其核心是通过一系列可靠高效又具有选择性及模块化的化学反应生成含杂原子的化合物，从而实现碳杂原子的连接(C—X—C)，突破传统化学合成方法的制约。

点击化学通常具有以下特征：反应模块化，可与其他反应组合；无有毒有害等副产物；反应效率高，接近定量；反应条件温和，对水和氧气不敏感；立体选择性好；实验原料易得等。鉴于以上优势，点击化学已成为目前的热门研究领域之一，并在材料科学和合成领域得到了大量的应用[2-5]。

原位点击化学(In situ click chemistry)[6]是目前点击化学在合成和其他应用中的常见方法。在合成过程中，参与点击反应的物质均在溶液中生成，无需进行分离提纯，只需向反应液中加入另一种能与之发生点击反应的试剂即可，简化了实验步骤，也在一定程度上提高了反应速率。将原位点击化学应用于合成类天然产物的研究中，以酶为反应模板，选择性地连接各模块组分，可发现各种酶的高亲和力抑制剂[7-9]。Bhardwaj等[10]以环氧合酶2为反应容器，将叠氮基标记的吡唑(5、14、27和31)和芳基乙炔进行成对孵育，鉴定出18和21号为环氧合酶2的特异性抑制剂。与临床使用的抗炎药相比，化合物18和21表现出优异的体内抗炎活性。Hirose 等[11]利用生理条件下的惰性反应物进行不可逆的靶标导向合成，生成了高亲和的抑制剂。通过含叠氮化物Nω-甲基氨基甲酰基-L-精氨酸与乙炔库之间的特异性偶极环加成反应，筛选出高亲和力的几丁质酶抑制剂，为进一步开发抑菌性药物提供了理论基础。此外，原位点击化学也被应用于体内肿瘤靶向治疗[12]、抗HIV病毒因子的筛选[13]、抗体合成[14]等生物医学领域。

随着各学科间的交叉融合，检测技术与点击化学联用后，展现出强大的分析检测性能[15-17]。由于点击化学反应速率快、立体选择性好、对溶剂不敏感等特点，基于点击化学构建的分析方法具有检测限低、线性范围广、可对目标分析物进行准确定量的优势，在快速检测方面有着良好的应用前景。

2 常见的点击化学反应分类

点击化学反应主要有4种：环加成反应、亲和开环反应、非醇醛的羰基反应和碳碳多键的加成反应。

2.1 环加成

环加成反应即充分利用模块化反应融合过程，将两种不饱和的反应物连接起来，形成各种五元杂环和六元杂环的反应，如Diels Alder反应及1,3-偶极环加成反应。研究最多的是1,3-偶极环加成反应，其中以炔烃和叠氮基的反应最为突出，由Arthur[18]在1983年首次报道，后由Huisgen等[19]正式确立为一类重要的新型反应。在一价铜的催化下，炔基和叠氮基的不饱和键发生成环反应(CuAAC反应)，形成1,2,3-三唑，该反应在室温下即可发生，且对氧气、pH值、温度等条件不敏感，为复杂有机物的合成和生物大分子的改性提供了强有力的技术支持。随着各种交叉学科的出现，当前基于新型点击反应试剂构建的各类CuAAC检测方法已有大量报道，主要包括荧光检测法、比色检测法、电化学检测法等(表1)。

表1 基于CuAAC反应的快速检测方法Table 1 Rapid detection methods based on the CuAAC reaction

CuAAC检测法通常具有反应基团易修饰、灵敏度好、结果可视化等优势，然而CuAAC反应需要引入一些具有潜在毒性的金属催化剂，使其在生物医药以及食品领域的应用受限。

2.2 亲和开环

亲和开环主要是三元杂原子张力环开环并释放张力能的过程，如环氧衍生物、氮杂环丙烷、环状硫酸酯、环状硫酰胺、吖丙啶离子等。在这些三元杂环化合物中，环氧衍生物和吖丙啶离子是最常用的底物，可在醇/水混合溶剂或无溶剂条件下开环形成各种高区域选择性化合物。此类反应还包括α,β-不饱和羰基化合物的迈克尔加成反应，主要用于天然产物和药物的合成[34-39]。

2.3 非醇醛的羰基化

非醇醛的羰基化反应又称“保护基反应”，是一类温和的羰基化合物缩合反应。此类反应包括：醛或酮与1,3-二醇反应生成1,3-环氧戊环；醛与肼或胲反应生成腙和肟；α-和β-羰基醛、酮和酯生成杂环化合物[40-42]。这些反应均能够在环境友好的体系中进行，且不产生有害副产物。

2.4 碳碳多键加成

碳碳多键加成反应通过将原子或基团加成在碳碳键两端，生成具有更高分子量的化合物，包含环氧化反应、二羟基化反应、氮杂环丙烷化反应、双氢加成以及巯基-烯反应等典型反应。

因不需要金属催化剂、反应原料范围广、具有点击反应的所有特性，巯基-双键反应近年来已成为点击反应的研究热点。根据双键化合物的不同，巯基-双键反应分为两种反应机理：(1)在光或热的条件下，巯基与烷烃单烯之间的自由基加成；(2)有机碱(有机胺、有机磷化物等)作为催化剂时，巯基与马来酰亚胺、(甲基)丙烯酸酯等共轭烯烃的巯基-迈克尔加成。Cleophas等[43]采用巯基-双键点击化学制备了一种具有优异抗菌性能的PEG基水凝胶涂层，经测试发现，该涂层对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大肠杆菌接种物具有>99%的完全杀死率，显示了巯-烯点击化学在抑菌方面的应用功能性。

3 点击化学在检测分析中的应用

3.1 食品成分及食品添加剂的检测

近年来，抗坏血酸常用作护色剂被添加到食品中，而摄入过量的抗坏血酸会导致人体出现一系列不良反应。Qiu等[24]利用CuAAC点击化学反应构建了一种超灵敏检测抗坏血酸(AA)的电化学传感器，将炔丙基功能化的二茂铁通过与修饰在金电极上的叠氮化末端发生点击反应修饰到电极上，并采用电化学交流阻抗法检测金电极在点击反应前后的电子转移电阻，以此确定不同浓度抗坏血酸的表面覆盖分数(θ) 。结果表明，θ值与抗坏血酸浓度对数值在 5.0×10-12～1.0×10-9mol/L范围内呈线性关系。该传感器检测限低至1.3×10-12mol/L，选择性和稳定性良好，并已成功应用于抗坏血酸的实际检测。

李燕萍等[25]利用巯基丙酸修饰纳米金，并借助酰胺反应分别构建了炔基和叠氮基修饰的两种不同的AuNPs，通过还原糖将Cu2+还原为Cu+触发两种AuNPs的CuAAC反应，实现了对还原糖的定量检测。该方法的检出限为0.001 5 μmol/L，可直接用于蜂蜜产品的还原糖检测。

3.2 农残兽残检测

当前检测农兽药残留的金标准方法主要是高效液相色谱-质谱法、气相色谱和质谱法，但是这些方法前处理复杂，需借助各种大型仪器，不适用于快速检测。Dong 等[21]基于点击化学原理，开发了一种快速高灵敏检测毒死蜱的免疫分析方法。研究者分别制备了聚谷氨酸(PGA)、叠氮基修饰的聚苯乙烯(PGA-Azide-PS1000)纳米粒子和炔基修饰的磁纳米颗粒(Alkyne-MNPs)，PGA和Cu2+之间可通过配位化学结合形成刷状纳米结构，调节体系中Cu2+的浓度可触发CuAAC。毒死蜱会阻止PGA-PS1000-抗原与MNPs-Ab之间形成MNPs-Ab-抗原-PS1000-PGA复合物，因此较少的Cu2+被PGA键合，溶液中更多游离Cu2+被抗坏血酸还原为Cu+从而发生CuAAC反应，导致PS1000-MNP30共轭物的形成。MNPs聚集状态以及浓度变化均会使磁传感器的横向驰豫(T2)发生变化，可通过测定体系的T2值来检测毒死蜱。这种点击化学和配位化学介导的免疫传感器可实现对毒死蜱残留物的超灵敏检测，检测限(0.022 ng/mL)较酶联免疫吸附法(1.28 ng/mL)提高了58倍，所用时间也比金标准法短(图1A)。

纳米金颗粒易与硫醇形成稳定的Au—S键，Fu等[22]利用叠氮化物和炔基化合物修饰的AuNPs之间的点击化学反应，开发了一种快速、高灵敏、肉眼可视化检测有机磷农药的方法(图1B)。多孔有机骨架孔隙率高、比表面积大，在溶剂中有很好的稳定性，Wu等[44]通过光催化的巯-烯点击化学制备了高度交联的共价有机骨架(CFOs)，将其固定在化学惰性不锈钢纤维(SSF)上用作固相微萃取(SPME)的涂层，并与气相色谱法联用对黄瓜中的农药残留量进行了检测。

杀螨剂氟咪唑嗪的炔基能够与3-叠氮-7-羟基香豆素反应，在Cu+催化下发生叠氮炔环加成生成强荧光的1,2,3-三唑，Lu等[23]据此开发了一种能够灵敏特异性检测氟咪唑嗪的荧光传感方法，线性范围为0.25～6.0 μg/L，检测限为0.18 μg/L(图1C)。

抗生素残留是继农药残留后又一严重的兽药残留问题，目前对食品中抗生素的检测仍以大型精密仪器分析法为主，其样品前处理复杂耗时，而点击化学与其他技术联用可大大缩短检测时长。Belal等[45]基于DNA适配体片段的互补作用以及Cu+催化的点击反应，开发出能够高灵敏、快速(2 h内)检测卡那霉素的荧光分析法。主要机理为：一条DNA单链采用生物素修饰，另一条DNA单链采用CuS纳米颗粒修饰，仅在卡那霉素存在的情况下这两条DNA单链互补形成双链，产生的卡那霉素-双链DNA-CuS经磁分离后，CuS被抗坏血酸还原为Cu+而触发3-叠氮基-7-羟基香豆素与炔丙醇之间的CuAAC反应，生成具有荧光的1,4-二取代-1,2,3-三唑。该反应体系荧光强度与卡那霉素浓度(0.04～20 nmol/L)具有良好的线性关系，方法检测限低至26 pmol/L。

Xianyu等[46]通过不同尺寸的反式环辛烯(TCO)功能化的聚苯乙烯珠(TCO-PS)和1,2,4,5-四嗪(Tz)功能化的30 nm磁珠(Tz-MNP30)之间的“TCO-Tz点击反应”制备了具有核-卫星结构的磁探针，结合抗体-抗原相互作用和磁分离，利用这些多功能磁探针产生的磁弛豫转换(Magnetic relaxation switching,MRS)信号可实现对多种抗生素的高灵敏检测。用该方法分别进行土霉素、磺酰胺和氯霉素的含量检测，所得结果准确可靠，并有望进一步应用于生物医学和食品安全检测。

图1 基于点击化学引起T2信号值变化检测毒死蜱(A)[21]，点击化学结合纳米金颗粒可视化检测有机磷农药(B)[22]， 利用点击化学生成强荧光的1,2,3-三唑(C)[23]Fig.1 Detection of chlorpyrifos based on changes in T2 signal value caused by click chemistry(A)[21], combination of click chemistry and gold nanoparticles to visually detect organophosphorus pesticides(B)[22]， preparation of 1,2,3-triazole with highly fluorescence using click chemistry(C)[23] 1.3-azide-7-hydroxycoumarin(3-叠氮化物-7-羟基香豆素);2.flumioxazin(氟米嗪);3.3-azide-7-hydroxycoumarin+Cu2++SA (3-叠氮化物-7-羟基香豆素+二价铜离子+链霉亲和素);4.flumioxazin+Cu2++SA(氟米嗪+二价铜离子+链霉亲和素); 5.3-azide-7-hydroxycoumarin+Cu2++SA+flumioxazin(3-叠氮化物-7-羟基香豆素+二价铜离子+链霉亲和素+氟米嗪)

3.3 真菌毒素检测

真菌毒素如黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等极易污染粮食、谷物、咖啡、啤酒和茶叶等，对动物和人具有致畸、致癌、致突变和免疫抑制等毒性作用[47-49]。当前，对AFB1、OTA、ZEN等的检测以传统的仪器分析法为主，如高效液相色谱法[50]、薄层色谱[51]等。这类方法灵敏度高且准确性好，但存在样品前处理复杂、需要专业操作人员和设备昂贵等不足，限制了其在基层的推广使用。因此，开发低成本快速检测抗生素的方法作为大型精密仪器分析法的有力补充显得尤为重要。

Qiu等[26]分别制备了叠氮基-OTA适配体修饰的磁珠(N3-OTA适配体-MBs，DNA1)和蔗糖转化酶功能化的炔基-DNA偶联物(炔基DNA-蔗糖转化酶，DNA2)，以个人血糖仪(Personal glucose meter,PGM)作为信号读出器建立了微量OTA(72 pg/mL)的检测方法。DNA1与DNA2间发生CuAAC反应形成双链的dsDNA，存在OTA时，OTA与其适配体结合，使得dsDNA双链解开，经磁珠分离后上清液中的DNA2量增多，PGM信号变强，从而实现对OTA的高灵敏检测。

Xu等[52]通过光引发多面体低聚倍半硅氧烷(Polyhedral oligomeric silsesquioxane,POSS) 单体聚合形成含活性烯基的刚性骨架，并在70 ℃下引发巯基化的玉米烯酮适体(SH-ZEN适体)和烯基间的“巯-烯点击化学”,得到被极性适体致密包被的亲和整体柱，最终与HPLC联用对大米中的ZEN进行检测，实验结果准确可靠。Chen等[53]基于自由基聚合和“硫醇-烯”点击反应，采用“一锅法”直接制备了一种新型的基于OTA适体的含POSS杂合亲和性整体柱，并用于啤酒样品中OTA的检测，该法特异性好且能够检测痕量OTA。

图2 点击化学引起的GO-C2和Rho-N3间的FRET效 应(A)[32]，点击化学形成的Mg2+依赖性DNA酶结合 血红素比色检测Cu2+(B)[30]Fig.2 FRET effect between GO-C2 and Rho-N3 caused by click chemistry(A)[32]，colorimetric detection of Cu2+ using Mg2+ dependent DNAzyme formed by click chemistry and heme(B)[30]

3.4 重金属检测

微量金属如铜、铁等是人体生长发育的必需元素，但摄入过量或者不足以及不平衡均会引起人体生理异常或发生疾病[54-55]。此外，环境中的重金属如汞、镉等也会影响人体健康[56-57]。因此，开发金属残留的高灵敏检测方法极为重要。

荧光共振能量转移(FRET)技术具有灵敏度高、反应速度快等优势，常作为反应信号放大手段用于分析检测。氧化石墨烯(GO)是一种理想的能量受体，可与许多物质发生FRET猝灭其荧光。Zheng等[32]利用炔基修饰的氧化石墨烯(GO-C2)和叠氮基修饰的罗丹明100(Rho-N3)间发生CuAAC反应导致Rho-N3的荧光被显著猝灭的机理，实现了Cu2+的高灵敏检测。该方法可以高效快速(1 min)地检测尿液中的Cu2+，为临床诊断提供了一定的理论基础(图2A)。

在AuNPs的局部表面等离子体激元共振(LSPR)和CuAAC反应高特异性的基础上，Zhou等[33]通过配体交换反应制备了叠氮基和炔基修饰的AuNPs，利用CuAAC反应使两种AuNPs交联并引发聚集使体系溶液从红色变为蓝色，进而通过肉眼对Cu2+进行了定性检测。Carol等[27]通过二炔交联剂诱导叠氮基修饰的AuNPs聚集实现了Cu2+的灵敏检测，检测限低至1.8 μmol/L。AuNPs易在高浓度盐溶液中发生聚集，导致颜色由红变蓝，但是谷胱甘肽存在时则会抑制这一现象。

除CuAAC反应外，光或热引发的“巯-烯”点击化学也常应用于材料修饰中。Zuo等[58]通过光引发的“巯-烯点击化学”合成咪唑官能化聚硅氧烷(PMMS-IM)，该材料在365 nm处表现出强烈荧光。过渡金属离子Fe3+等能够与富电子基团发生配位结合而引起荧光猝灭，故作者将PMMS-IM用作Fe3+的荧光检测探针，并用于检测Hela细胞中Fe3+的原位循环。

脱氧核酶(DNAzyme)是在体外筛选、扩增获得的一种具有催化功能的DNA片段[59]，可形成G-四链体并结合血红素，适用于小分子、金属离子、DNA等的检测。Li等[30]结合Cu+催化的点击化学和Mg2+依赖性DNAzyme循环扩增的策略，开发了一种可灵敏检测人血清中Cu2+的比色传感法，该方法的线性范围为5～500 nmol/L，检测限低至2 nmol/L(图2B)。

CuAAC反应生成的三唑环在检测体系中具有极大的作用：(1)作为与目标分析物的结合位点；(2)作为离子载体与荧光团之间的连接基团。Hou等[29]利用CuAAC反应合成了含有两个三唑环的新型二甲苯苯基环烷烃1，其在292 nm激发波长处具有强荧光。在甲醇溶液中，该环烷烃1的三唑环能特异性地结合Ag+，同时，由于螯合增强荧光猝灭(CHEQ)效应，使得环烷烃1的荧光被显著猝灭，从而可实现对Ag+的检测。Zhang等[33]利用Cu+触发UiO-66-N3与苯乙炔的点击反应，合成了一种新型金属有机骨架(MOF)荧光探针UiO-66-PSM，该探针的三唑环可以与Hg2+配位结合猝灭UiO-66-PSM的荧光，较其他金属离子表现出更明显的荧光响应，且在水溶液中有很好的稳定性，可用于环境水体中Hg2+的检测。

Fomo等[28]基于叠氮基苯胺盐酸盐与炔烃封端的金属钛氰(MPc)的CuAAC反应，制备了一种新型低对称炔末端钴——酞菁钴(CoPc)。将该CoPc经差动脉冲溶出伏安法(DPSV)修饰于玻碳电极上，可同时检测Hg2+、Cu+、Pb2+、Cd2+和As3+等金属离子。

3.5 食源性致病菌

食源性疾病是全球最突出的公共卫生问题之一，随着食品供应链的快速发展，食源性疾病在全球各地的蔓延不仅危害人体健康，还会造成严重的经济问题。目前食源性致病菌的检测手段主要是传统的选择性平板培养和凝集实验等，以上方法存在操作繁琐、检测周期长等缺点，不能满足食源性致病菌快速检测的迫切需求。

Huang等[60]开发了一种无酶生物传感器用于快速(1 h内)检测沙门氏菌。研究者首先制备了姜黄素-牛血清白蛋白纳米颗粒(CUR-BSA)，通过反式环辛烯(Tz)-1,2,4,5-四嗪(TCO)间的无铜点击化学反应形成Tz-TCO-CUR复合物后将其进行抗体功能化，并结合磁分离技术对沙门氏菌进行定性和定量检测，方法检测限低至50 CFU/mL。

此外，Guo等[16]综合旋转磁分离法、金纳米管(GNR)指示法以及Tz-TCO点击化学信号放大法，建立了一种检测鼠伤寒沙门氏菌的比色免疫传感器。该免疫传感器检测时间为3 h，线性范围为101～105CFU/mL，检出限为35 CFU/mL。

大肠杆菌(E.coli)能够特异性地捕获环境中的Cu2+将其还原为Cu+，Mou等[20]基于此并利用叠氮-AuNPs和炔烃-AuNPs的CuAAC反应，实现了对大肠杆菌的快速灵敏检测。当存在E.coli时，外源性Cu2+被E.coli还原为Cu+而触发CuAAC反应，导致金纳米颗粒聚集并使体系由红色变为蓝色，仅用肉眼即可快速轻松地实现病原菌的检测。

4 结论与展望

作为一类新型的合成反应，点击化学由于其生物相容性和环境友好性等优势被大量研究，并在诸多领域得到广泛应用。值得注意的是，将免疫分析法和点击化学反应有效结合，能够实现分析物更加快速灵敏的检测，例如，利用基因工程技术制备抗体与反应底物催化酶的融合蛋白用于替代传统免疫分析法中的一抗和酶标二抗，能够减少孵育反应次数和洗涤次数，极大地缩短检测时间，同时避免了过多孵育和洗涤次数对灵敏度的影响。当前，点击化学在食品安全检测领域的应用研究尚处于初期阶段，尽管已取得了较好的研究进展，但现阶段点击化学自身存在的局限性仍需引起研究人员的重视。如：(1)点击化学的发生需要特定的反应基团参与，而在纳米材料上修饰反应基团则操作繁琐费时；(2)点击化学反应类型较少，已报道的点击化学反应大部分都是叠氮化物与端基炔的1,3-偶极环加成反应和巯基-烯加成反应；(3)需要加入过量的铜盐使点击化学反应完全，提高了反应成本；(4)叠氮化合物危险性高、毒性强，严重威胁研究人员的生命健康。因此，针对上述问题，亟需开发出更为经济、绿色、安全的点击化学反应类型，使点击化学在食品安全检测领域得到更为深入的研究，同时有助于拓宽点击化学在其他研究方向的应用。