基于电化学传感器检测赭曲霉毒素A的研究进展

李林芝，何赛君，黄添增，刘 星,3,4,5，陈 奇,3,4,5， 陈 健,3,4,5，曹宏梅,3,4,5*

(1.海南大学 食品科学与工程学院,海南 海口 570228；2.海南大学 化学与工程技术学院,海南 海口 570228；3.海南省食品营养与功能食品重点实验室,海南 海口 570228；4.热带多糖资源利用教育部工程 研究中心,海南 海口 570228；5.海南省南海水产资源高效利用工程研究中心,海南 海口 570228)

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是一种由赭曲霉、青霉菌等真菌产生的次级代谢产物，广泛存在于粮谷类、饲料、坚果、葡萄及葡萄酒、咖啡及其制品中[1]。虽然OTA在食品中的含量极少，但其能长期在人体和动物体中积累，不仅对肝脏、肾脏损害极大，还对神经系统和免疫系统具有毒性，可能致畸和致癌[2]。

OTA具有的广泛毒性引起了国内外的关注。1993年，国际癌症研究中心将OTA认定为ⅡB类致癌物[3]。随后，欧盟、美国等[4]国家针对OTA在不同食品中的含量制定了限量标准，如直接使用谷物加工品中OTA限量标准为3.0 μg/kg，未经加工谷物为5.0 μg/kg，葡萄酒为2.0 μg/kg。我国针对谷物、豆类、辣椒及其制品等也规定了严格的OTA限量标准，其中谷物及加工品、豆类中OTA限量为5.0 μg/kg。2017年，我国增加了对葡萄酒和咖啡中OTA的限量指标[5-6]，其中葡萄酒为2.0 μg/kg，咖啡豆和咖啡粉为 5.0 μg/kg，速溶咖啡为10.0 μg/kg。同时，GB 5009.96-2016规定了食品中OTA的标准检测方法，并针对不同检测方法规定了检出限或定量下限[6]。因此，食品中OTA含量的检测对保障人民身体健康具有重要意义。

目前已有较成熟的OTA检测方法，如薄层色谱法[7]、高效液相色谱法[8]、酶联免疫吸附技术[9]、时间分辨荧光免疫分析技术[10]、胶体金免疫层析技术[11]、化学发光酶免疫分析技术[12]等。其中，薄层色谱法和胶体金免疫层析技术方法简单,所用试剂廉价，但灵敏度低；高效液相色谱法的灵敏度高、重现性好，但成本高、操作过程复杂；酶联免疫吸附技术操作简单，但灵敏度低。而电化学传感作为快速发展的新检测方法，具有灵敏度高、稳定性好、检测范围广、快速、便携等优点，为OTA的定性、定量快速检测提供了新的发展方向。近年来，研究者们开发了大量灵敏度高、稳定性好、检测范围宽的新型OTA电化学传感器，且广泛应用于谷物[13]、葡萄[14]、咖啡[15]等实际样品中OTA含量的检测。本文综述了近年来电化学传感在OTA检测方面的研究进展及在食品安全领域中的应用，为后期OTA电化学传感在快速检测领域的发展提供了一定参考。

1 OTA电化学传感的原理及分类

近年来，利用电化学传感在OTA检测方面得到了快速发展，其检测原理是基于识别分子和目标物之间在电极表面发生氧化还原反应所产生电流的变化进行分析[16]。因此，电化学传感兼具化学反应和电化学传导的优势，如高特异性、强亲和力、高灵敏性和反应性。此外，电化学传感还具有易便携、微型化、消耗试剂少、无需复杂前处理等优点[17]。因此，结合OTA的特征和现代检测技术的要求，电化学传感已成为目前分析OTA浓度的潜在方法。信号识别分子是电化学传感的重要组成部分，根据OTA目标物信号识别分子不同，例如适配体[18]、抗体[17-18]、分子印迹聚合物[19]，OTA电化学传感主要可以分为三类，即基于核酸适配体的电化学传感、基于抗原-抗体的免疫电化学传感和基于分子印迹的电化学传感。本文将从此三方面具体介绍OTA电化学传感的发展及其在食品安全领域中的应用。

2 基于核酸适配体的OTA电化学传感及其应用

适配体是一种单链DNA或RNA核酸片段，含有10～50个可变碱基序列，能特异性识别目标物，如蛋白质、核酸、毒素、细胞、细菌等。通过配体的系统进化指数富集技术可筛选合适的适配体序列，从含有不同序列的大型文库中对寡核苷酸进行多次的选择和扩增。2008年,Cruz-Aguado和Penner[20]首次通过配体的系统进化指数富集技术分离出OTA适配体序列。适配体作为电化学传感器构建中的高效识别分子，具有生产成本低、容易修饰、稳定性好、亲和力强、特异性高等优势，因此，基于OTA适配体的电化学传感器成为近几年的研究热点。 表1总结了近5年基于OTA适配体的电化学传感方法快速检测OTA的研究工作。从表中可以看出，除了在电极表面直接连接OTA适配体[21-30]，不同类型的纳米材料也越来越多地应用于OTA适配体传感器的构建。例如具有良好导电性的纳米金颗粒可直接电镀到电极表面形成金层，或使用导电性好的银离子，以起到信号放大的效果[31-38]。还有研究者将金纳米粒子与其他金属粒子结合，构建更灵敏的OTA电化学适配体传感器[39-44]。除了金属纳米材料，碳纳米材料(如石墨烯、碳纳米管、碳气凝胶)[45-52]和有机纳米材料(如聚苯乙烯)也应用到OTA适配体传感器的构建[53-55]，以改进传感器的灵敏度与稳定性。上述基于纳米材料构建的OTA适配体传感中，根据应用的电化学技术不同，可分为电流型OTA适配体电化学传感和电阻型OTA适配体电化学传感。

表1 基于适配体的OTA电化学传感Table 1 Electrochemical sensors based on OTA aptamer

2.1 电流型OTA适配体电化学传感

电流型电化学传感是基于工作电极在含有电活性物质的溶液中产生电流，通过峰电位的位置识别作用靶点，并通过峰电位的数值变化表征电化学传感器的性能。目前该技术已经成为一种强大的电化学生物传感技术，常用的伏安技术有差分脉冲伏安法(DPV)、循环伏安法(CV)和方波伏安法(SWV)。

基于纳米材料的电流型OTA适配体传感主要利用DPV、CV和SWV 3种技术进行检测。根据检测目标物(OTA)引起的电流信号变化，可进一步细分为电流降低型OTA适配体电化学传感和电流增大型OTA适配体电化学传感。如基于单一贵金属纳米粒子(Au、Pt、Ag)[31,33,36,38]及双金属纳米粒子[39,42,44]构建的电流降低型OTA适配体电化学传感。由于双金属的协同作用，基于双金属纳米粒子构建传感器表现出更高的电催化活性。同时，有研究者利用双金属纳米粒子与金属有机物结合，构建了高灵敏的电流型OTA适配体传感。如Zhang等[39]在铁卟啉金属有机骨架上原位沉积AgPt双金属纳米粒子，形成了金属有机聚合物作为探针分子的电流降低型OTA适配体传感(图1A)。当无OTA时，通过链霉亲和素和生物素作用，AgPt/PCN-223-Fe结合OTA适配体，产生强氧化还原电化学信号，导致DPV峰电流增加，但当OTA存在时，适配体更易结合OTA，使得DPV峰电流值降低。此传感器的检出限可低至14 fg/mL，已成功应用于红酒和玉米样品中OTA含量的检测。随着石墨烯材料的广泛开发，氧化石墨烯材料由于稳定性强和能够促进电子转移，因此成为理想的构建OTA电化学传感器的界面材料。Prabhakar等[46]基于石墨烯掺杂壳聚糖复合物构建电流降低型适配体传感(如图1B)，由于石墨烯能增加电极的活性比表面积，而壳聚糖能阻止适配体的泄漏，此传感已成功应用于葡萄汁中OTA含量的分析，检出限可达 1 fg/mL。

图1 电流型OTA适配体传感器的构建Fig.1 Fabrication of OTA aptasensing based the change of current A.current reduction adaptor sensing based AgPt bimetallic nanoparticles decorated iron-porphyrinic metal-organic framework(基于 AgPt双金属负载金属有机物的电流降低型OTA适配体传感);B.current reduction adaptor sensing based on graphene doped chitosan nanocomposites(基于石墨烯掺杂壳聚糖复合物的电流降低型OTA适配体传感);C.current amplification OTA aptamer sensing based on exonuclease I-assisted silver-metallized(基于核酸外切酶- 辅助的银金属化电流增大型OTA适配体传感);D.current amplification OTA aptamer sensing based on graphene oxide nanosheets and DNase I-based target recycling reaction (基于氧化石墨烯纳米片-硫堇的信号放大型OTA适配体传感)

相比电流降低型OTA适配体电化学传感，电流增大型OTA适配体电化学传感因具有降低背景信号干扰，提高分析灵敏度等优势，近年来引起研究者的广泛关注。deMello等[32]最近发展了一种核酸外切酶-辅助的银金属化电流增大型OTA适配体电化学传感(如图1C)，此传感器以金属银作为信号增强器，利用核酸外切酶降解未结合适配体，可抑制背景信号，提高传感器检测灵敏度。该传感器用于啤酒中OTA含量的检测，检出限为0.7 pg/mL。Sun等[51]也构建了基于氧化石墨烯的电流增大型OTA适配体传感器，该传感器由硫堇-核酸适体共轭组装的氧化石墨烯纳米片、脱氧核糖核酸酶I组成。在OTA存在下，脱氧核糖核酸酶I裂解为硫堇-适配体/目标分子复合物，通过监测硫菫分子的电流变化，可定量评估小麦样品中OTA的浓度(如图1D)。

2.2 电阻型OTA适配体电化学传感

电阻型免疫电化学传感器的建立是通过表征电化学阻抗值的变化。当工作电极表面修饰抗体、OTA等分子后，分子的阻挡作用使其表面的电子传递效率降低，从而导致阻抗值增大。近年来，研究者利用电化学阻抗技术构建了阻抗型OTA适配体电化学传感。目前的研究中，大多为电阻增大型OTA适配体传感，Bi等[34]以巯基化适体在金基底上的自组装单分子膜为基础，构建了无标记阻抗型OTA适配体传感器。该方法成功地应用于白酒和葡萄汁中OTA的检测，其检出限为0.03 ng/mL，低于一步法硫酰化DNA适配传感器。

除了以纳米金为基底构建OTA适体传感器，研究人员还着力于探究新的金属材料在电化学中的应用，Zhou等[40]基于Cu-Co类普鲁士蓝立方体复合物耦合金纳米粒子构建了阻抗型OTA适配体传感(图2A)。此双金属立方体复合物显示了优良导电性，强适配体结合力，以及稳定四面体，可实现对果汁样品中OTA浓度的定量分析，检出限低至5.2 fg/mL。最近，Marty等[21]发展了基于廉价、高活性比表面积的铅笔石墨检测OTA的新型电化学阻抗型适配体传感(图2B)，其检测范围为 0.1～2.0 ng/mL，检出限可达0.1 ng/mL，并成功应用于啤酒样品中OTA的检测。

图2 电阻型OTA适配体传感器的构建Fig.2 Fabrication of OTA impedimetric aptasensing A.based on the bimetallic(Cu-Co) prussian blue analogue loaded with gold nanoparticles(AuNP@CuCoPBA)(基于Cu-Co类 普鲁士蓝复合物载入金纳米粒子);B.based on modified pencil graphite electrodes(基于铅笔石墨)

3 基于抗原-抗体的OTA免疫电化学传感及应用

免疫电化学传感是基于抗原-抗体的特异性识别作用进行定性定量的分析方法。OTA是非免疫原性小分子，能与特异性抗体(如单克隆抗体、多克隆抗体、噬菌体模拟表位肽、纳米抗体)进行结合。目前，基于免疫型电化学传感器检测OTA的研究相对较少，其中大多是基于金属纳米材料的良好性能而构建，表2总结了近10年基于抗原-抗体的电化学免疫传感检测OTA的研究[56-68]。根据应用的电化学技术的不同，免疫电化学传感可分为电流型免疫电化学传感和电阻型免疫电化学传感。

表2 基于抗原-抗体的电化学免疫传感检测OTATable 2 Electrochemical immunoassay based on antigen-antibody for OTA detection

3.1 电流型OTA免疫电化学传感

在已报道的电流型OTA免疫电化学传感中，根据检测策略不同，可分为直接检测型[56-64]和竞争型[65-67]。Solanki等[57]报道了利用直接检测策略构建电流型OTA免疫电化学传感。其将壳聚糖碳化成氨基功能化的碳纳米材料，同时原位生长氧化锆纳米粒子(nZrO2)，构建的传感器显示良好的性能，利用DPV技术对OTA直接进行特异性检测，其检出限为1 ng/mL，此传感器被应用于咖啡样品中OTA的定量分析(图3A)。Bechelany等[68]发展了免标记型免疫电化学传感直接检测OTA，利用原子层沉积技术在碳毡电极表面负载Pd纳米粒子，然后共价连接抗-OTA单克隆抗体，构建了BSA/anti-OTA/PdNPs/CF传感。此传感对稀释咖啡样品中的OTA显示良好分析性能，检出限可达 0.096 ng/mL。

Vidal等[65]发展了竞争型OTA电化学免疫传感,OTA-BSA和OTA-BSA-AuNPs分别作为工作电极，连接多克隆抗OTA抗体构建两种间接免疫传感(图3B)，结果显示基于金纳米结构的传感具有更低的检出限，此传感器可应用于小麦中OTA含量的测定。尽管基于单克隆抗体、多克隆抗体构建的OTA免疫电化学传感显示了良好的性能，如高特异性、良好重现性、低检出限等，但存在抗体之间交叉反应的不足。为了克服上述缺点，研究者们开发其他类型的OTA识别分子，如噬菌体模拟表位肽、纳米抗体等。He等[66]利用噬菌体模拟表位肽构建了高灵敏的竞争型OTA电化学免疫传感器(图3C)，可忽略交叉反应的影响，所建免疫传感器的检出限为2.04 fg/mL，线性范围为7.17～548.76 fg/mL，已应用于玉米、啤酒两种样品中OTA含量的检测。

3.2 电阻型OTA免疫电化学传感

电阻型免疫电化学传感器的建立大多通过电化学阻抗值的变化来表征，如抗体、OTA等分子的阻挡作用使工作电极表面的电子传递效率降低，从而导致阻抗值增大。近年的研究也多基于电化学阻抗值增大的原理建立电阻型免疫电化学传感器。如Jaffrezic-Renault等[59]通过磁场作用，利用磁性纳米粒子将OTA单克隆抗体固定在修饰的金电极表面，构建了电阻型OTA免疫电化学传感，检出限可达 0.01 ng/mL(图4A)。

随着不同材料的应用及电化学检测方法的建立，研究人员成功构建了电阻减小型OTA免疫电化学传感器，获得了较低的检出限，并取得了良好的实际样品检测效果。2016年，Tang等[67]通过构建全新阻抗型免疫电化学传感器，实现了对红酒样品中OTA含量的检测(图4B)。实验将信号分子Mn2+固定在OTA多克隆抗体与氧化石墨烯-聚合物模板上，当OTA存在时，分析物、固定在电极上的OTA-BSA、氧化石墨烯-聚合物模板与OTA抗体之间发生竞争反应，二氧化锰高效催化剂可在无H2O2情况下催化4-氯-1-萘酚(4-CN)在电极上的沉淀，构建的竞争型免疫传感器的电阻抗值会随着样品中OTA浓度的增加而降低。

4 基于分子印迹聚合物的OTA电化学传感及应用

分子印迹聚合物(MIP)是模板分子(目标化合物)从聚合物中去除后的分子印迹过程的最终产物。其内部具有与模板分子互补的孔道形状，这赋予了MIPs的高度选择性和模仿自然抗体和生物受体的能力，同时具有高稳定性、可重复性利用等优点。因此MIPs被广泛应用于分离纯化、催化、传感等领域[18]。Pacheco等[69]利用OTA分子印迹聚合物构建了OTA电化学传感，传感器显示了高的稳定性和重复性，并成功应用于啤酒和白酒中OTA含量的测定。目前已开发的基于适配体、抗体、分子印迹的新型OTA电化学传感器在谷物、葡萄、咖啡等样品中得到广泛应用，方法具有良好的检测性能，因此其在食品安全检测领域中具有重要的应用价值。

5 展 望

近年来，用于OTA检测的电化学传感器发展迅速，成为OTA快速检测的新选择和新发展趋势，有望取代复杂、耗时的传统方法。将电化学检测技术与纳米材料相结合，构建基于抗原-抗体的OTA免疫传感或基于适配体的OTA适体传感能获得更低的检出限和更宽的检测范围。不同金属纳米颗粒、复合纳米材料、有机纳米材料等已被应用于传感器的构建。然而，目前的电化学传感器大部分仅限于理论研究，无法针对复杂的食物基质进行现场快速分析。因此急需开发出可靠、灵敏的可用于复杂样品快速现场分析的传感器。因此，对于该领域进一步的研究方向仍需开发新的具有高稳定性和优异功能的纳米材料,并将其与电化学技术相结合，构建稳定性更高、检出限更低的OTA电化学传感器，以克服传感器稳定性差等不足。近几年，本课题组 Liu 等成功筛选出OTA纳米抗体——分子量小、性能优异纳米抗体，并应用于ELISA[70]或FRET[71]技术。但目前，尚无将OTA纳米抗体应用于电化学传感领域，这也是本课题组未来的研究方向。我们相信基于纳米抗体的电化学传感将有更多的开发空间。