人源MDN1蛋白质的电镜结构研究

许云涛，李明月，雷鸣

上海交通大学医学院附属第九人民医院上海精准医学研究院，上海200125

核糖体是人体内负责蛋白质合成的重要细胞器，影响着机体生长和繁殖等一系列活动。核糖体的组装和成熟是一个高度复杂的过程，受到很多组装因子的精密调控［1-3］，该过程的异常会导致心血管、神经、骨骼、造血系统等方面的疾病，如骨髓增生异常综合征（Shwachman-Diamond syndrome，SDS）、先 天 性 角 化 不 良（dyskeratosis congenita，DC）等［4-6］。在众多参与调控核糖体组装的蛋白质因子中，AAA-ATPase（ATPase associated with various activities）［7］家族是受到广泛关注的一类蛋白质，该家族成员在不同阶段参与释放或者回收不同的pre-60S核糖体组装因子，推动核糖体的成熟过程。AAA-ATPase家族成员具有2个基本的特征：其一是氨基酸序列中含有1个或多个保守的AAA结构域，AAA结构域具有ATP水解酶活性，通过水解ATP获得能量来发挥其生理功能［8］；其二是大多数AAA-ATPase能够形成寡聚体，互相结合，协同作用，最常见的是形成doughnut-shaped的六聚体环状结构，这是其发挥生理功能的结构基础［9-11］。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，有3种AAA-ATPase参与pre-60S核糖体成熟过程，分别为Ribosome biogenesis ATPase Rix7（Rix7）、Developmentally-regulated GTPbinding protein 1（Drg1）和Rea1［1］。Rix7是第1个与pre-60S核糖体相互作用的AAA-ATPase，主要与组装因子NOP seven-associated protein 1（Nsa1）释 放 有 关［12-13］；Drg1主要在胞质中发挥作用，促进组装因子回收［14-15］；而Rea1促进Pescadillo homolog（NOP7）pre-60S complex和Pre-rRNA-processing protein（Rix1）pre-60S complex中的组装因子释放，是pre-60S核糖体在核仁以及核质成熟中的关键因子［16］。

在上述3种AAA-ATPase中，Rea1作为在核内调控pre-60S核糖体组装因子释放的重要蛋白质，其敲低、敲除可致酵母死亡，在其他真核生物中对发育也有非常大的 影 响［17-21］。实 验 表 明，Rea1的metal ion-dependent adhesion site（MIDAS）结构域与pre-60S核糖体组装因子Ribosome biogenesis protein Ytm1-Erb1-Nop7（Ytm1-Erb1-Nop7）的MIDAS-interacting domain（MIDO）结构域相互作用，Rea1将Ytm1从pre-60S核糖体上释放出来［16，22］；此外还发现Rea1在Rix1 pre-60S核糖体中丰度很高，并且通过其ATPase环状结构域与Rix1 pre-60S核糖体相互作用［18，22-23］。最 近发表的酵母 源（Schizosaccharomyces pombe）的结构信息显示，该蛋白质由6个AAA结构域、连接肽（linker）、天冬氨酸/谷氨酸（D/E）以及MIDAS结 构 域组成［24-25］；通过AMPPNP和ATP-ribozinoindole1（ATP-Rbin1）2种不同状态的对比发现，MIDAS结构域可能通过插入AAA环与pre-60S核糖体的组分相互作用，从而介导多种组分从pre-60S核糖体释放［26］。

Rea1在人源的同源蛋白质为midasin AAA-ATPase 1（MDN1），是体内相对分子质量最大的蛋白质之一，全长包含5 596个氨基酸残基，相对分子质量为632 000。MDN1在pre-60S核糖体成熟中发挥着非常重要的作用，但是其相关结构生物学研究进展缓慢，这很大程度上限制了我们对pre-60S核糖体在核内成熟以及装配的理解。目前对MDN1结构和功能的了解，较多是基于对酵母Real的研究结论，因此，解析人源MDN1的蛋白质结构，对于阐明包括人类在内的哺乳动物MDN1调控pre-60S核糖体成熟过程的分子机制有着非常重要的意义。本研究通过哺乳细胞表达和蛋白质纯化体系，获得全长人源MDN1蛋白质样品，借助120 kV透射电子显微镜和单颗粒（singleparticle）重构技术，获得了MDN1蛋白质的负染三维结构模型，为后续解析高分辨MDN1结构奠定了坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1主要试剂和仪器三羟基甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）、氯化钠（NaCl）、氯化镁（MgCl2）、甘油（Glycerol）、二 硫 苏 糖 醇（DTT）、20×磷 酸 缓 冲 液（PBS）、吐温-20（Tween-20）均购自上海生工生物工程公司，cocktail购自瑞士Roche公司，限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶均购自美国Thermo Fisher公司，牛血清白蛋 白、dulbecco′s modified eagle medium（DMEM）、ANTI-FLAG® M2 Agarose Affinity Gel均购自Sigma（上海）公司，悬浮细胞培养基购自CELL-WISE公司；高速离心机、超速离心机购自美国Beckman Coulter公司，冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，电泳仪与电泳槽购自Bio-Rad（中国）公司，细胞流式分选仪购自美国BD公司，细胞计数仪、高分辨轨道阱质谱仪均购自美国Thermo Fisher公司，激光扫描共聚焦显微镜购自德国ZEISS公司，碳膜铜网购自北京中镜科仪技术有限公司，透射电子显微镜购自美国FEI公司。

1.1.2载体、菌株和细胞pX330-mCherry载体、pUC57载体、E.coli DH5α菌种、Expi293F细胞均由本实验室保存。

1.2 实验方法

1.2.1引物合成和DNA序列测定均由上海铂尚生物技术有限公司完成。

1.2.2质粒的构建针对MDN1基因的5′端设计包含sgRNA靶位点（cac cgc aag aag tgc tcc atg acc c）的引物，体外退火后连接入pX330-mCherry载体［27］，作为CRISPR/Cas9系统［28］gRNA表达质粒。同时构建一段含有MDN1基因起始密码子上游1 kb基因组序列，3×FLAG标签（tag）（DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGGSG GS）编码序列，以及下游1 kb基因组序列的供体序列，连接在pUC57载体，作为CRISPR/Cas9系统修复供体质粒。

1.2.3 FLAG-MDN1细胞株构建将CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达质粒和修复供体质粒同时转染Expi293F细胞，采用DMEM（10% FBS）培养，48 h后进行流式分选，将mCherry阳性细胞单克隆分选至96孔板。对存活细胞进行传代培养。存活细胞培养至一定数量后，抽提基因组进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）验 证（MDN1-FLAG-for，CTC GGG GTG AGG GCC CTG GGT CGC CAC CAT GGA CTA CAA GGA CCA CGA CGG；MDN1-doner-rev，ACT CAC CTG TCC CGT GGC TCA CG）；全细胞裂解液用FLAG抗体进行蛋白质印迹法（Western blotting）验证。阳性细胞扩大培养至悬浮状态，悬浮细胞在无血清悬浮培养基，37℃、5% CO2、140 rpm条件下培养。在细胞密度约为3×106/mL的条件下收取，后进行蛋白质纯化。

1.2.4免疫荧光（immunofluorescence，IF）鉴定提前24 h将细胞培养在玻片上。将培养基吸掉，用4%多聚甲醛室温固定20 min，PBST（PBS+0.5%聚乙二醇辛基苯基醚，TritonX-100）处理15 min，封闭液（5% BSA+PBS+0.1% TritonX-100）封闭30 min，加FLAG一抗4℃孵育过夜。用PBST洗3次，加荧光二抗，室温孵育40 min。之后用PBST洗3次，加DAPI室温染色5 min，封片。之后在共聚焦显微镜上观察。

1.2.5 MDN1蛋白质纯化表达目的蛋白质的Expi293F细胞用1 000×g离心20 min，弃上清，用裂解缓冲液（50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、400 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2、10%Glycerol、1 mmol/L DTT、cocktail）重悬，采用液氮冻存法冻存细胞，液氮研磨法裂解细胞。细胞裂解后经39 190×g离心50 min，取上清与ANTI-FLAG®M2 Agarose Affinity Gel在4℃低速旋转混合4 h，Gel用洗涤缓冲液（50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、400 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2、10% Glycerol、1mmol/L DTT）洗去杂蛋白质，再用含200 ng/μL FLAG Peptide的洗脱缓冲液（50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、120 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L DTT）洗脱目的蛋白质。将蛋白质样品用100 kD浓缩管浓缩至200μL，通过10%～30%甘油密度梯度离心法，用SW60转子，184 500×g，4℃，14 h分离纯化目的蛋白质。结束后每200μL收集，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析鉴定目的蛋白质。

1.2.6蛋白质组分的质谱鉴定由于许多样品中加有去污剂，需要事先沉淀洗涤处理之后才能上机。样品的处理方法步骤如下：首先沉淀样品去除样品中去污剂如TritonX-100，乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P 40，NP40），十二烷基-beta-D-麦芽糖苷（N-Dodecyl-β-D-maltoside，DDM）等。之后重新溶解样品，还原烷基化，用胰蛋白酶，37℃酶解过夜。最后对酶解溶液进行脱盐处理，通过液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）进行分析；质谱原始数据提交到Proteome Discoverer 2.3软件中，使用UniProt数据库中的人（Homo sapiens）蛋白质数据库进行检索。

1.2.7负染样品制备、数据收集及模型构建因甲酸双氧铀（uranyl formate，UF）溶液渗透能力较强并且颗粒非常细腻，故选择其作为样品的负染色液。负染电镜实验步骤如下：对碳膜铜网进行亲水化处理后，取3μL蛋白质溶液滴于碳膜铜网，吸附1 min；用滤纸从碳膜铜网边缘轻轻吸去多余的溶液，滴加10μL UF负染色液（ρ=0.75%），洗2次，染色1 min；用滤纸吸去多余液体，室温晾干；晾干后将样品置于120 kV透射电镜中观察，放大倍数设置为57 000倍，欠焦值设置为-1～-2μm；选择样品颗粒分散性和均一性较好的区域进行数据收集。随后利用数据处理软件EMAN2［29］和RELION［30］对所收集的图像进行处理并产生一个三维模型。

1.2.8 MDN1蛋 白 质 结 构 预 测I-TASSER（Iterative Threading ASSEmbly Refinement）是由密歇根大学开发的在线蛋白质结构与功能预测的工具［31］，预测的原理是不相似的氨基酸序列也可以对应着相似的蛋白质结构。它能从PDB（Protein Data Bank）数据库里识别结构模板，通过基于迭代模板的片段组装模拟来构建完整的结构模型。接着通过蛋白质功能数据库BioLiP对3D模型重新线程化，从而预测靶标的功能。由于MDN1蛋白质较大，只对其6个AAA结构域预测，获得相应的蛋白质三级结构预测数据。

2 结果

2.1 构建内源表达FLAG-MDN1的细胞株

人源MDN1全长包含5 596个氨基酸残基，分子量较大，进行克隆和外源表达的难度非常高，因此我们采用对Expi293F细胞内源敲入标签的方法进行内源表达。在MDN1蛋白质的N端敲入FLAG标签，用于亲和层析（图1A）。通过CRISPR/Cas9对Expi293F细胞MDN1基因组N端进行定点剪切，再通过带有FLAG标签的修复供体进行修复，然后利用流式细胞术分选mCherry阳性的单克隆Expi293F细胞进行培养。获得的单克隆细胞株抽提基因组DNA进行PCR验证，部分的细胞株样品能够获得预期的特异性PCR产物，说明相应的细胞株已经敲入目的FLAG标签（图1B）。进一步，利用FLAG抗体对全细胞裂解液进行Western blotting分析，结果显示阳性克隆细胞株能够检测到目的条带（图1C），表明带有N端FLAG标签的MDN1蛋白质可以正确表达。另外我们也采用IF技术，检测FLAG-MDN1的表达和定位（图1D）。上述3种不同的检测方法，都证实FLAG纯化标签在MDN1蛋白质N端成功敲入，获得正常表达FLAG-MDN1融合蛋白质的Expi293F细胞株。

2.2 MDN1蛋白质的纯化

对标签敲入成功的阳性细胞株进行扩大悬浮培养，收取6 L细胞（约1.8×1010个细胞）用裂解缓冲液重悬后，采用液氮研磨法破碎细胞。细胞裂解后经高速离心取上清，利用ANTI-FLAG亲和层析方法获得目的蛋白质。纯化富集的蛋白质样品采用Western blotting和银染的方法进行检测（图1E、F），证实得到的样品主要包含目的蛋白质FLAG-MDN1。将纯化样品采用体积分数为10%～30%的甘油通过密度梯度离心法进行分离纯化，进一步提高样品的纯度和均一性；密度梯度离心获得的样品按200μL/管进行组分收集，通过SDS-PAGE和银染鉴定不同的收集组分，选取纯度和均一性较好的样品用于后续的实验（图1G，孔道9～11）。

图1人源内源FLAG-MDN1蛋白质纯化Fig 1 Purification of the human endogenous FLAG-tagged MDN1 protein

2.3 MDN1蛋白质负染电镜数据收集和三维模型的构建

在获得高纯度且均一性较好的MDN1蛋白质样品后，采用负染色电镜技术和单颗粒重构技术分析目的蛋白质的三维模型。对碳膜铜网进行亲水化后，将样品吸附到碳膜铜网，经重金属甲酸双氧铀（UF）染色，通过120 kV透射电镜观察，结果表明样品在负染条件下蛋白质浓度合适，颗粒分散性和均一性较好（图2A）。大部分颗粒的形状为长条形，长度约29 nm，和预期分子量大小基本相符（图2A）。部分颗粒的形状偏向圆形，可能是MDN1蛋白质6个AAA结构域的投影。我们在57 000放大倍数条件下共收集负染照片103张，运用EMAN2软件手动挑选颗粒，共挑出16 103个颗粒，之后使用RELION软件进行二维分类平 均（2D classification）（图2B）和 三 维 分 类（3D classification）计算。结果表明MDN1蛋白质结构特征明显（图2C），用于三维重构的颗粒角度分布均匀（图2D）。

2.4 MDN1蛋白质初步结构分析

负染数据进一步经过三维优化处理（3D auto-Refine），最终获得分辨率约为45Å的人源MDN1蛋白质负染三维结构模型（图3A）。整个蛋白质大小为140Å×170Å×340Å（图3B），其整体轮廓和已报道的酵母源的MDN1蛋白质较为相似［24］。已有的研究预测MDN1蛋白质含有6个AAA结构域（图1A）［10］，借助I-TASSER软件对该结构域进行模拟，结果如图所示（图3C）；进一步对模拟结果通过UCSF Chimera［32］自动匹配，大致确定了AAA结构域在MDN1蛋白质负染结构模型中的位置（图3D）。将我们的负染三维模型和已报道的酵母源MDN1的蛋白质结构进行比较，发现二者的AAA结构域在整体结构中的定位是类似的（图3D）［24］。这进一步表明MDN1蛋白质结构在酵母和人之间是较为保守的。

3 讨论

由于核糖体在细胞中的重要性，其装配成熟过程一直是相关研究领域的一个热点问题。已有的研究表明，AAA-ATPase在pre-60S核糖体成熟和出核过程中发挥着重要作用［10］。尽管MDN1功能有一些研究报道，也有研究者在2018年发表了酵母源MDN1的高分辨率结构［24-25］，但是人源MDN1的结构研究进展缓慢，目前尚无任何高分辨率结构的报道，这限制了研究人员对MDN1在哺乳动物pre-60S核糖体成熟过程中发挥作用的分子机制的理解。虽然氨基酸序列分析表明酵母源与人源MDN1蛋白质在某些结构域有一定的保守性，但有研究认为人源MDN1在pre-60S核糖体成熟过程中被招募的机制可能有所不同，与其相互作用的核糖体组装因子也有所差异，例如在人源细胞中MDN1能够被SUMO化的proline-，glutamic acid-and leucine-rich protein 1（PELP1）招募至pre-60S核糖体［20］。因此，解析人源MDN1蛋白质结构对于阐明哺乳动物MDN1的具体功能和相关机制有重要的意义。

图2负染电镜分析MDN1蛋白质Fig 2 Negative-staining electron microscopy analysis of MDN1

图3 MDN1蛋白质三维模型和AAA结构域的定位Fig 3 Three-dimensional reconstruction of MDN1 and localization of AAA domains

MDN1蛋白质分子量非常巨大，外源表达有一定的难度，并且整体结构也不适合采用晶体结构生物学方法进行解析，所以我们在Expi293F细胞的MDN1蛋白质的N端敲入亲和纯化标签FLAG，通过亲和层析获得少量的纯化样品进行电镜结构解析。通过负染色技术和单颗粒重构技术（single-particle），获得了MDN1蛋白质低分辨率三维结构。从整体轮廓看，MDN1的结构在人源细胞和酵母内是较为保守的。另外，我们也利用结构预测和分子对接的方法，初步确定人源MDN1的AAA结构域在整体结构中的定位。

MDN1属于AAA-ATPase家族成员，该家族蛋白质包含至少一个结构上非常保守的AAA结构域，再组装为功能活跃的环状结构。不同于其他寡聚化的AAA-ATPase复合物，MDN1蛋白质氨基酸序列包含有6个AAA结构域，能够通过自身的肽链折叠，形成相应的环状结构。事实上，我们的负染结构模型也表明人源MDN1是以单体的形式存在，并且有类似的AAA环状结构，这和酵母源的MDN1是一致的。为了得到人源MDN1高分辨率的结构，下一步我们将着重提高MDN1的纯化产量，尝试冷冻电镜分析。由于采用Expi293F内源表达的方法，获得的MDN1纯化样品相对较少，6 L细胞得到的目的蛋白量为100～120μg，我们将通过扩大细胞培养量，解决这个蛋白质产量限制问题，以期获得MDN1蛋白质的冷冻电镜高分辨结构，阐明MDN1在pre-60S核糖体成熟中发挥作用的结构基础。

参·考·文·献

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