急性肺损伤动物模型建立的研究进展

付静怡，汪雷，杨异

上海交通大学附属第六人民医院胸外科，上海200233

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是1994年由美国-欧洲共识会议委员会首次提出，由多种直接或间接因素（包括但不限于感染、创伤、中毒、休克、肺炎、输血、免疫反应等）导致氧合指数（oxygenation index，OI）≤300 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）的概念，常常导致低氧血症性呼吸衰竭甚至急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的 发 生［1-3］。ALI时，急性全身性炎症反应可引起微血管损伤，使肺血管和上皮的通透性增加，蛋白质和富含炎性细胞的液体流入肺泡腔，导致非心源性肺水肿，气体交换肺泡-毛细血管减少，进而导致低氧性呼吸衰竭及ARDS［4-5］；临床上表现为胸闷气促、呼吸困难、进行性低氧血症，影像学上可表现为肺渗出性改变［1］。目前ALI的病死率仍相当高，为29%～42%，且与致病因素有很大关系；败血症的病死率约为43%，肺炎和误吸的病死率分别为36%和37%，重大创伤则为11%［6］。

虽然ALI的凶险程度很大，但关于其发病机制及治疗措施进展不大，因此建立动物模型来模拟ALI很有必要。ALI的动物模型建立，可依据其病因分为生物因素诱导的ALI模型、输血模型、物理撞击模型、呼吸机模型，以及缺血再灌注模型，此外还有缺氧模型、免疫反应模型等。所用动物最常用的为小鼠、大鼠、白兔等小动物模型，也有狗、羊、猪等大动物模型。本文就ALI的动物模型建立方法进行综述。

1 ALI的诱导方法

1.1 生物因素诱导的ALI

在临床上，脓毒血症患者极易发生ALI，在脓毒血症患者中ALI的发病率和病死率分别高达40.2%和30%～85%［7］，因此在ALI的动物模型建立中，以脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）为代表的生物因素诱导脓毒血症致ALI是最常见的方法。

Zhang等［8］在其研究中就用到了LPS诱导小鼠ALI。他们选用7周龄的雄性小鼠，在小鼠8周龄时对其进行处理：将小鼠吸入异氟醚进行麻醉，实验组小鼠经气管注入20μg LPS及50μL无菌生理盐水的混合溶液，对照组小鼠只注射50 mL无菌生理盐水，观察比较2组的肺损伤程度。Morales-Ortíz等［9］也使用了此方法：选用8～10周龄、体质量20～23 g的小鼠。小鼠腹腔注射氯胺酮+甲苯噻嗪进行麻醉，实验组和对照组分别用10μg LPS及无菌磷酸盐缓冲液滴鼻，比较2组肺损伤程度。Song等［10］使用狗来建立动物模型，选用13.75～14.65 kg的雄性犬，对照组静脉输注0.9%的生理盐水，肺损伤组先静脉输注0.9%的生理盐水，30 min后静脉注射LPS（1 mg/kg），10 min后再静脉输注0.9%的生理盐水。而Passmore等［11］选择了37～48 kg的3岁非孕母羊，麻醉后在4 h内静脉注射剂量递增的LPS来诱导ALI。

1.2 输血所致急性肺损伤动物模型

输血所致急性肺损伤（transfusion-related acute lung injury，TRALI）十分常见［6］。当输血后6 h内急性发作，及OI＜300 mmHg，胸部X线摄片可见肺部双侧浸润改变，无体液性肺水肿迹象，且无其他ALI危险因素时，即可以高度怀疑TRALI［12-13］。

Vlaar等［14］曾建立过TRALI模型，供体鼠选择250 g雄性大鼠，麻醉后使用含有柠檬酸盐-磷酸-葡萄糖的注射器收集血液，离心分离出血小板以供输注，在30 min内向受体鼠输注供体血液。而在Fung等［15］的研究中则利用非直接输血的方法制造了小鼠TRALI模型。有文献报道［16］单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）可诱导TRALI类似症状，实验选用6～12周的雄性小鼠，通过尾静脉注射不同浓度混有mAb的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）模拟小鼠TRALI模型。

1.3 钝性撞击下的ALI动物模型

临床上创伤导致的ALI又称肺挫伤。尽管其严重程度并不高，但其发病率相当高，且患者往往合并肋骨骨折、全身多处骨折、胸腔积液、肺不张等合并症。肺挫伤对患者的呼吸功能有一定影响［17］。因此，在ALI动物模型的建立中，钝性撞击的模拟非常重要。

Kao等［18］的研究制造了钝性胸部创伤（blunt chest trauma，BCT）的小鼠ALI模型，方法：将250～300 g的大鼠外周注射苯巴比妥钠麻醉，取其仰卧位固定于平板上，四肢用胶带固定，将一圆柱状金属分别从不同高度自由坠落至大鼠右胸侧（防止心肌损伤）。Wang等［19］、Aksu等［20］采用同样的方法制造钝性胸部创伤模型。Smith等［21］利用枪击制造肺挫伤模型，方法为选取体质量40～50 kg的猪，麻醉后使用特制螺栓枪枪击，模拟右侧肺挫伤。

1.4 机械通气导致ALI动物模型

临床常见使用呼吸机所致的ALI，因此有许多利用机械通气诱导建立ALI动物模型的方法［22］。López-Alonso等［23］使用此种方法：通过腹腔内注射氯胺酮及甲苯噻嗪的混合物麻醉小鼠，然后切开小鼠气管进行机械通气，用2种不同水平的压力［15 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa）、100次/min和20 cmH2O、50次/min］分别诱导温和及严重的ALI，并在开始时和2.5 h后进行取样研究。Neudecker等［24］的实验中也用了类似的方法：腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠，切开气管后将气管插管连接机械呼吸机，使用45 cmH2O的高吸气压力持续3 h通入纯氧，诱导ALI。Kreyer等［25］则用羊制造动物模型，将非孕母羊麻醉后行气管插管，容量控制模式下进行呼吸机机械通气从而诱导ALI。

1.5 缺血-再灌注所致ALI动物模型

在肺移植、休克、肺栓塞、肺袖状切除术后等情况下，ALI的发病率非常高，而其发病机制主要为肺的缺血-再灌注（ischemia reperfusion，IR），因此动物实验中缺血-再灌注模型是使用较多的一种方法。

在Chen等［26］的研究中使用了此类方法：选用体质量20～25 g的小鼠，麻醉后对小鼠实施开胸手术，左肺门钳夹1 h并松开，再灌注1 h。Jia等［27］的动物实验采用类似方法：选用210～250 g的大鼠，通过外周注射戊巴比妥钠麻醉，实验组对大鼠行开胸手术后将小鼠左侧肺门夹紧1 h，再松开1 h，并观察左肺的膨胀不张的程度，确保肺缺血再灌注的充分进行；对照组只接受开胸手术并不进行肺门夹闭。在Grimm等［28］的研究中，动物模型选取3～5 kg的新西兰家兔，麻醉后行右心室切开术，在肺主动脉处插入一根输入导管，在左心房处插入一根输出导管，然后结扎上下腔静脉和主动脉，使心肌缺血，将兔进行肝素化处理后经右心室导管灌注300 mL自体血，左心房插管用于监测血压。

1.6 化学因素致ALI动物模型

中毒、误吸所致ALI在临床也很常见。Patel等［29］使用盐酸制造ALI小鼠模型：选用10～12周龄25～30 g的小鼠，腹腔麻醉后气管内注射等渗盐酸溶液，再进行肺损伤评估。Liu等［30］用家兔建立模型：选用2.7～3.2 kg的成年雄性家兔，静脉注射戊巴比妥钠进行麻醉，实验组气管内注射pH=1.5的盐酸溶液诱导ALI，对照组只注射同等剂量的无菌生理盐水。

1.7 其他因素致ALI动物模型

缺氧所致ALI模型也有报道。Allard等［31］利用氯气制造缺氧致ALI小鼠模型。Carnesecchi等［32］报道利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）缺陷的小鼠制造缺氧性ALI模型。Rangarajan等［33］使用博来霉素制造小鼠药物致ALI模型。

2 ALI的评估方法

2.1 病理学评估

病理学观察是判定肺损伤程度的金标准。优点在于取样简单，观察评估简便准确；缺点在于只能将动物处死后取材，可能因为肺损伤后活体动物的病理表现存在一定的差异。模拟ALI的动物模型实验基本用此种方法，步骤为：处死动物后将肺取出，利用石蜡制片及苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，H-E staining）法将肺组织切片固定染色，在光学显微镜下观察。

2.2 炎性介质浓度评估

支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）以及血清中炎性介质含量是除病理学外用到最多的评估肺损伤严重程度的方法。据文献报道，肺损伤严重程度与各种炎性介质如巨噬细胞、中性粒细胞、细胞因子计数密切相关。当ALI时，中性粒细胞及巨噬细胞的募集浸润，各种炎症因子如白细胞介素-1β（interleukin-1β）、炎性小体域蛋白3（recombinant NLR family，pyrin domain containing protein 3，NLRP3）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等以及肺泡细胞相关蛋白质等的释放均起到了重要作用［34-37］。

通过重复注射及回抽PBS缓冲液收集BALF，或者直接留取血清样品进行测定。在经过离心固定等操作后进行巨噬细胞及中性粒细胞计数，通过酶联免疫吸附测定和蛋白质印迹法分析IL-1β、NLRP3、NF-κB等指标的浓度，以及通过蛋白电泳等方法计算蛋白质浓度。

2.3 微计算机断层扫描成像

微计算机断层扫描成像（micro-computed tomography，微CT）是评估ALI的一种常用方法，具有快速、无创、连续的体内成像功能，是研究小鼠肺部病理变化的强大工具［38］。使用微CT对小鼠肺部进行体内成像，不仅可以在不干扰组织的情况下进行更完整的分析，还可以最大限度地减少数据插值的需要［39］，且CT影像学在临床中应用较广、较便捷，因此这种方法在临床上的可操作性较高，不足之处在于需要一定的技术支持。

2.4 肺干/湿比

肺干/湿比（dry/wet ratio）可以用来评估肺水肿的严重程度。方法为：动物死亡时取全肺称重，确定湿重；置于烘箱中烘干后称重，确定干重；计算干/湿比。

2.5 血气分析

由于肺损伤时通气血流比例失衡，氧结合能力下降，动脉血氧分压下降，因此血气分析（blood gas analysis，BGA）可以作为评估肺损伤程度的重要指标。

2.6 肺泡液体清除率

用肺泡液体清除率（alveolar fluid clearance，AFC）评估肺损伤程度的报道较少。Patel等［29］报道，在15 min内需完成操作：诱导ALI后处死小鼠，在小鼠气管内注射含有荧光标记牛血清白蛋白的等渗液再重复回抽。计算AFC百分比：［1-（F0/F30）］×100%，其中F0是时间t=0时参照样品中含有荧光标记的蛋白浓度，F30是t=30 min时含有荧光标记样品的浓度。这种方法操作复杂，可操作性较低，一般不常用。

3 ALI的评估结果

通过比较模型组及对照组的肺损伤指标，可以得出：①肺损伤组的肺组织病理学表现为肺泡间质性水肿、肺泡壁厚度增加、中性粒细胞数量增多、肺组织斑块状出血。其病理学表现随损伤程度加重而更加明显。②炎性指标是除病理学诊断外最常用的指标。多种实验证实，在ALI时中性粒细胞及巨噬细胞募集增多，在伤后48 h后最为敏感；各种炎症因子如IL-1β、NLRP3、NF-κB、HIF-1α、TNF-α等均有不同程度的升高，其中尤以IL-1β最为敏感；而肺泡细胞相关蛋白质浓度也可以作为评估肺损伤程度的指标。③微CT扫描显示急性肺损伤动物肺密度较对照组明显增加，肺三维重建图像可以生动地显示出肺损伤的区域和程度，可以看出ALI动物的肺容量明显减少。④肺水肿是肺损伤时的重要表现之一，肺损伤组的肺干/湿比显著降低，且肺损伤程度越高，肺干/湿比越低。⑤在肺损伤时，动脉血氧分压可有不同程度的下降。但其结果受影响因素较多，因此只能作为参考而不是诊断的指标。⑥当肺泡损伤时，AFC可下降。实验结果表明，AFC在伤后前2 d呈显著下降趋势，在伤后第二天到达最低点，而后可缓慢升高。

4 总结

综上所述，ALI作为胸外科及呼吸科常见的危急疾病之一，其发病率和病死率均相当高，如不及时处理，严重时可引发ARDS甚至死亡。因此，建立动物实验模型模拟ALI并进一步研究肺损伤发病的分子机制、治疗干预措施等实验，对ALI的早期诊断和治疗有很大帮助。

近年来的研究报道表明ALI的动物模型建立方法已初步成型，根据其病因可分为：以LPS为主的生物因素模拟全身感染，间接导致炎性反应性ALI；输血因素先引发机体自身免疫反应，继而引发ALI；物理钝性撞击则通过外力作用直接导致ALI；机械通气可直接导致肺泡破裂、肺毛细血管通透性增加，引起ALI；缺血-再灌注模型也可直接诱导肺血管的缺血-再灌注，直接导致ALI的发生；化学因素直接作用于呼吸系统导致的ALI等。其中，化学因素所致ALI程度最严重，动物模型病死率极高；输血导致的自身免疫性ALI程度一般较轻；而其他因素受干预因素的剂量影响较大，无法进行ALI程度上的横向对比。

实验动物依据实验方法选取，如化学因素模型多以20～50 g小鼠为主，钝性撞击模型则多以200～300 g大鼠或大动物模型为主。幼年及老年动物对损伤的耐受性较差，因此所选动物均为成年动物，如小鼠一般为7～10周龄。尚未有研究表明所选动物的性别、品系对实验结果存在影响。

麻醉方法多为腹腔内麻醉，也可使用肌内注射、吸入麻醉等方法。麻醉药物以氯胺酮及甲苯噻嗪、巴比妥类及异氟醚较常用。

评估肺损伤程度可使用组织病理学、肺泡灌洗液及血液中炎性介质浓度、微CT成像、血气分析、肺干/湿比、肺泡液体清除率等方法。其中，病理学、肺干/湿比评估方法需取样肺组织，因此只能适用于动物实验，临床上几乎没有可实施性。微CT成像在临床上可实施性较大，且操作便捷，但在动物实验中技术尚不完全成熟，实验误差无法避免。血气分析受干扰因素较多，结果参考意义不大。肺泡液体清除率操作复杂，不便于实施。炎性介质浓度测定较方便，结果有意义，在动物实验及流程上可操作性空间均较大，因此可作为建模的重要指标。

外伤所致ALI（肺挫伤）的动物实验鲜有报道，但肺挫伤在临床上的发病率较高且致命，其发病机制及治疗措施尚未明确。未来可参考相关实验方法并加以优化，对肺挫伤的病理生理及治疗干预措施进行深入研究。

参·考·文·献

[1]Fanelli V,Ranieri VM.Mechanisms and clinical consequences of acute lung injury[J].Ann Am Thorac Soc,2015,12(Suppl 1):S3-S8.

[2]Butt Y,Kurdowska A,Allen TC.Acute lung injury:a clinical and molecular review[J].Arch Pathol Lab Med,2016,140(4):345-350.

[3]Hughes KT,Beasley MB.Pulmonary manifestations of acute lung injury:more than just diffuse alveolar damage[J].Arch Pathol Lab Med,2017,141(7):916-922.

[4]Allen TC,Kurdowska A.Interleukin 8 and acute lung injury[J].Arch Pathol Lab Med,2014,138(2):266-269.

[5]Chambers E,Rounds S,Lu Q.Pulmonary endothelial cell apoptosis in emphysema and acute lung injury[J].Adv Anat Embryol Cell Biol,2018,228:63-86.

[6]Johnson ER,Matthay MA.Acute lung injury:epidemiology,pathogenesis,and treatment[J].J Aerosol Med Pulm Drug Deliv,2010,23(4):243-252.

[7]Fujishima S,Gando S,Daizoh S,et al.Infection site is predictive of outcome in acute lung injury associated with severe Sepsis and septic shock[J].Respirology,2016,21(5):898-904.

[8]Zhang Y,Li X,Grailer JJ,et al.Melatonin alleviates acute lung injury through inhibiting the NLRP3 inflammasome[J].J Pineal Res,2016,60(4):405-414.

[9]Morales-Ortíz J,Deal V,Reyes F,et al.Platelet-derived TLT-1 is a prognostic indicator in ALI/ARDS and prevents tissue damage in the lungs in a mouse model[J].Blood,2018,132(23):2495-2505.

[10]Song Z,Cui Y,Ding MZ,et al.Protective effects of recombinant human brain natriuretic peptide against LPS-induced acute lung injury in dogs[J].Int Immunopharmacol,2013,17(3):508-512.

[11]Passmore MR,Byrne L,Obonyo NG,et al.Inflammation and lung injury in an ovine model of fluid resuscitated endotoxemic shock[J].Respir Res,2018,19(1):231.

[12]Vlaar AP,Juffermans NP.Transfusion-related acute lung injury:a clinical review[J].Lancet,2013,382(9896):984-994.

[13]Semple JW,Rebetz J,Kapur R.Transfusion-associated circulatory overload and transfusion-related acute lung injury[J].Blood,2019,133(17):1840-1853.

[14]Vlaar APJ,Hofstra JJ,Kulik W,et al.Supernatant of stored platelets causes lung inflammation and coagulopathy in a novel in vivo transfusion model[J].Blood,2010,116(8):1360-1368.

[15]Fung YL,Kim M,Tabuchi A,et al.Recipient T lymphocytes modulate the severity of antibody-mediated transfusion-related acute lung injury[J].Blood,2010,116(16):3073-3079.

[16]Kelher MR,Masuno T,Moore EE,et al.Plasma from stored packed red blood cells and MHC class I antibodies causes acute lung injury in a 2-event in vivo rat model[J].Blood,2009,113(9):2079-2087.

[17]Stolz A,Schutzner J,Lischke R.Pulmonary contusion[J].Rozhl Chir,96(12):488-92.

[18]Kao RL,Huang W,Martin CM,et al.The effect of aerosolized indomethacin on lung inflammation and injury in a rat model of blunt chest trauma[J].Can J Surg,2018,61(6):S208-S218.

[19]Wang S,Ruan Z,Zhang J,et al.A modified rat model of isolated bilateral pulmonary contusion[J].Exp Ther Med,2012,4(3):425-429.

[20]Aksu B,Ayvaz S,Aksu F,et al.Effects of sphingosylphosphorylcholine against oxidative stress and acute lung injuryınduced by pulmonary contusion in rats[J].J Pediatr Surg,2015,50(4):591-597.

[21]Smith S,McCully B,Bommiasamy A,et al.A combat relevant model for the creation of acute lung injury in swine[J].J Trauma Acute Care Surg,2018,85(1S Suppl 2):S39-S43.

[22]Dhar SM,Breite MD,Barnes SL,et al.Pulmonary contusion in mechanically ventilated subjects after severe trauma[J].Respir Care,2018,63(8):950-954.

[23]López-Alonso I,Blázquez-Prieto J,Amado-Rodríguez L,et al.Preventing loss of mechanosensation by the nuclear membranes of alveolar cells reduces lung injury in mice during mechanical ventilation[J].Sci Transl Med,2018,10(456):eaam7598.

[24]Neudecker V,Brodsky KS,Clambey ET,et al.Neutrophil transfer of miR-223 to lung epithelial cells dampens acute lung injury in mice[J].Sci Transl Med,2017,9(408):eaah5360.

[25]Kreyer S,Scaravilli V,Linden K,et al.Early utilization of extracorporeal CO2removal for treatment of acute respiratory distress syndrome due to smoke inhalation and burns in sheep[J].Shock,2016,45(1):65-72.

[26]Chen K,Xu ZC,Liu YK,et al.Irisin protects mitochondria function during pulmonary ischemia/reperfusion injury[J].Sci Transl Med,2017,9(418):eaao6298.

[27]Jia Y,Chen K,Lin P,et al.Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair[J].Nat Commun,2014,5:4387.

[28]Grimm JC,Zhang F,Magruder JT,et al.Accumulation and cellular localization of nanoparticles in an ex vivo model of acute lung injury[J].J Surg Res,2017,210:78-85.

[29]Patel BV,Wilson MR,Takata M.Resolution of acute lung injury and inflammation:a translational mouse model[J].Eur Respir J,2012,39(5):1162-1170.

[30]Liu Y,Tao T,Li WZ,et al.Regulating autonomic nervous system homeostasis improves pulmonary function in rabbits with acute lung injury[J].BMC Pulm Med,2017,17(1):98.

[31]Allard B,Panariti A,Pernet E,et al.Tolerogenic signaling of alveolar macrophages induces lung adaptation to oxidative injury[J].J Allergy Clin Immunol,2019,144(4):945-961.e9.

[32]Carnesecchi S,Deffert C,Pagano A,et al.NADPH oxidase-1 plays a crucial role in hyperoxia-induced acute lung injury in mice[J].Am J Respir Crit Care Med,2009,180(10):972-981.

[33]Rangarajan S,Bone NB,Zmijewska AA,et al.Metformin reverses established lung fibrosis in a bleomycin model[J].Nat Med,2018,24(8):1121-1127.

[34]Sherman MA,Suresh MV,Dolgachev VA,et al.Molecular characterization of hypoxic alveolar epithelial cells after lung contusion indicates an important role for HIF-1α[J].Ann Surg,2018,267(2):382-391.

[35]Aires ID,Boia R,Rodrigues-Neves AC,et al.Blockade of microglial adenosine A2A receptor suppresses elevated pressure-induced inflammation,oxidative stress,and cell death in retinal cells[J].Glia,2019,67(5):896-914.

[36]Grzanka R,Damasiewicz-Bodzek A,Kasperska-Zajac A.Tumor necrosis factor-αand Fas/Fas ligand signaling pathways in chronic spontaneous urticaria[J].Allergy Asthma Clin Immunol,2019,15:15.

[37]Voicu S,Balas M,Stan M,et al.Amorphous silica nanoparticles obtained by laser ablation induce inflammatory response in human lung fibroblasts[J].Materials,2019,12(7):1026.

[38]de Langhe E,Vande Velde G,Hostens J,et al.Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography[J].PLoS One,2012,7(8):e43123.

[39]Langheinrich AC,Leithäuser B,Greschus S,et al.Acute rat lung injury:feasibility of assessment with micro-CT[J].Radiology,2004,233(1):165-171.