鼻咽癌高癌家系癌患者外周血淋巴细胞S100A9表达分析*

陈舒华 谷婷婷 刘湘 胡学锋 肖红云 周志明 吴彦娴 张晴 何坤武

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma NPC）为鼻咽部上皮细胞来源恶性肿瘤细胞，以鳞状细胞低分化癌多见，占90%[1]。中国及东南亚地区为鼻咽癌高发地区，我国以广西、广东、湖南、江西、福建等地区鼻咽癌高发[2]。研究发现我国鼻咽癌发病率及死亡率占全球鼻咽癌发病和死亡的38.29%和40.14%，发病率和死亡率高于世界平均水平（1.2/10 万，0.7/10万）[3]。鼻咽癌因其位置隐匿，当出现鼻腔症状及体征时，多为临床晚期，较多患者以颈部淋巴结转移来院就诊。我国鼻咽癌患者发病率以青壮年多见，鼻咽癌死亡率以老年患者多[3]。鼻咽癌具有明显遗传倾向，且具有家族聚集倾向，对于鼻咽癌患者一级亲属进行鼻咽癌筛查及监测具有必要性[4，5]。S100A9分子蛋白为钙离子结合蛋白，为S100 蛋白家族重要一员。钙离子作为细胞内普遍存在的第二信使，引发包括自分泌在内的多种细胞过程代谢、细胞分裂和细胞生长。钙结合蛋白作为细胞内钙受体分子,细胞内钙水平的变化影响细胞功能上的变化。S100A9 分子蛋白为钙离子结合蛋白，其参与细胞及组织的生长分化、生长抑制、细胞凋亡、炎症反应、细胞信息通路传导。本研究小组曾对鼻咽癌高癌家系进行相关蛋白组学研究，发现鼻咽癌高癌家系及散发鼻咽癌患者癌组织中S100A9 存在差异性表达，但其外周血淋巴细胞中S100A9 是否存在差异，尚不清楚。本研究探讨鼻咽癌高癌家系气虚型癌患者外周血淋巴细胞S100A9 的表达，报道如下。

资料与方法

1 临床标本

入组标准：高癌家系是指直系亲属中有3 个以上成员确诊患癌症，其中二个以上为鼻咽癌，鼻咽癌患者在取标本前均未接受过放化疗，且均为未分化非角化性鳞状细胞癌；分期采用鼻咽癌2008 分期标准[6]。样本均选自佛山市第一人民医院头颈放疗科和佛山市第二人民医院就诊的患者，临床及病理资料完备。收集高癌家系鼻咽癌患者外周血标本、散发鼻咽癌患者外周血标本各22 例，同时收集体检中心正常人外周血标本22 例，分别提取外周血单个核细胞备用。

2 主要试剂

BCA 定量试剂盒为Solarbio。兔抗人Hsp27 与兔抗人β-actin 均为Abcam 公司抗体。Thermo 公司辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG 二抗。RNA 提取试剂盒为QIAGEN 公司RNeasy mini kit74104 试剂盒。逆转录试剂盒为Thermo 公司RevertA 外资id First strand CDNA synthesis kit#1622。real-time PCR 试剂盒为生物工程（大连）有限公司DRR420A SYBR Premix Ex Taq。PCR 引物为奥科鼎盛生物科技有限公司提供。

3 外周血淋巴细胞的制备

用EDTA 抗凝管抽取外周血10ml,迅速颠倒混止血液凝固。4h 内用淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞，-80°冰箱保存备用。

4 Western blot 检测

S100A9 蛋白表达的情况用RIPA 裂解液冰上裂解外周血淋巴细胞30min 后，BCA 法检测并计算总蛋白浓度，每孔上样40μg 蛋白后用BIO-RAD 垂直电泳系统分离目的蛋白，BIO-RAD 半干转转膜仪电转 30min。以 1∶3000 稀释的 S100A9 及 1∶5000 稀释的β-actin 抗体4℃孵育过夜，以1∶5000 稀释的HRP 标记羊抗兔 lgG（H+L）二抗结合一抗，ECL 发光液检测蛋白相对表达量。

5 RT-PCR 检测 S100A9 mRNA

5.1 引物设计及合成

利用生物信息学和参考文献获取基因序列；运用Primer Premier 6.0 软件，并参照有关文献设计引物。

引物序列如下（见表1）：

表1 S100A9 引物序列

5.2 逆转录

在无菌通风条件下按RNeasy mini kit74104 试剂盒说明书提取外周血淋巴细胞中总RNA，置于冰上，美国Thermo fisher 公司的NanoDrop 2000/2000c紫外可见分光光度计检测总RNA。OD260/OD280 在1.9 到2.1 之间者为合格品，取1μL 于电泳槽内跑RNA 胶，RNA 未降解样品继续用于逆转录。以500ng 总RNA 为模板，按逆转录试剂盒RevertAid First strand cDNA synthesis kit#1622 说明书配置逆转录反应体系，采用随机引物法反转录细胞内mRNA，使之成为cDNA。设置逆转录反应条件：25℃孵育5min，然后42℃孵育60min。70℃5min 终止反应。

5.3 RT-PCR

反转录完成后，用2μl cDNA 配制Real-time PCR 体系，按SYBR Premix Ex Taq 试剂盒说明书配制反应体系。每个样本做三个复孔，反应液配制完成后，离心混匀后置于荧光定量PCR 仪器上按照下列条件进行 PCR 反应：第一步：95℃ 30s（预变性）×1循环→第二部：PCR 反应（95℃5s，60℃30s，72℃30s）×40 循环→第三步：融解反应（95℃1min，55℃30s，95℃30s）×1 循环，在每个循环结束后，仪器自动采集并收集荧光信号。

6 统计学方法

所有数据均采用SPSS 21.0 统计软件进行分析。计量数据均用均数±标准差表示。检验标准取α=0.05，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。Western blot灰度分析时，为使不同凝胶电泳组的结果更具有可比性，统一将同组蛋白相对含量的最大值标准化为1，组间比较采用t 检验或one-way ANOVA 检验。计量数据均用均数±标准差表示。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

结果

1 S100A9 Real Time PCR 结果

Real Time PCR 结果分析：Real Time PCR 分析的表达采用比较2-△△Ct值的相对定量方法推算样本中的S100A9 的cDNA 模板起始量。对照组选择正常人外周血淋巴细胞组；分析S100A9 基因在散发鼻咽癌组、高癌家系鼻咽癌组外周血淋巴细胞中的表达。Real Time PCR 反应结束后，结果如（图1、图2）：从最大基线后开始，目的基因的扩增曲线出现指数增长期和平台期，说明有产物扩增；溶解曲线显示是单一的峰，说明所设计的引物有较高的特异性，扩增出单一产物。比较三组中S100A9 mRNA 差异，结果显示S100A9 mRNA 在22 例高癌家系鼻咽癌、散发鼻咽癌、正常人外周血中的△Ct 分别为-3.886±1.663；-3.421±1.110；-4.031±1.586。差异无统计学意义（P=0.363），见表 2。

图1 荧光定量PCR 检测S100A9 基因在正常组、散发组、高癌组中的表达扩增曲线图

图2 荧光定量PCR 检测S100A9 基因在正常组、散发组、高癌组中的表达溶解曲线图

表2 高癌家系外周血淋巴细胞中S100A9 mRNA 的△Ct 值比较（）

表2 高癌家系外周血淋巴细胞中S100A9 mRNA 的△Ct 值比较（）

F 值 =1.030，P 值 =0.363★注：★表示三组间方差分析比较P＞0.05，差异无统计学意义。

组别 例数 S100A9 mRNA 相对表达量高癌家系鼻咽癌 22 -3.886±1.663散发鼻咽癌 22 -3.421±1.110正常人 22 -4.031±1.586

2 S100A9 蛋白在人外周血单个核细胞及组织中的表达

S100A9 蛋白在高癌家系鼻咽癌组、散发鼻咽癌组、正常人组外周血单个核细胞中的表达分别为0.518±0.353；0.481±0.344；0.245±0.202，方差不齐（P=0.005），选择基于方差不齐的Welch 法，差异有统计学意义（P=0.019）。选择基于方差不齐的Dunnett’s T3 法多重比较：高癌家系鼻咽癌组与正常人组比较，差异有统计学意义（P=0.020）；散发鼻咽癌组与正常人组比较，差异有统计学意义（P=0.042）；高癌家系鼻咽癌组与散发鼻咽癌组比较，差异无统计学意义（P=0.745)，见图3、表3。

图3 外周血淋巴细胞中高癌家系组、散发组与正常人组蛋白条带

表3 高癌家系外周血淋巴细胞中蛋白相对表达量比较（）

表3 高癌家系外周血淋巴细胞中蛋白相对表达量比较（）

F 值 =3.459，P 值 =0.019★注：★表示三组间方差分析比较P＜0.05，差异无统计学意义。

组别 例数 S100A9 蛋白相对表达量高癌家系鼻咽癌 22 0.518±0.353散发鼻咽癌 22 0.481±0.344正常人 22 0.245±0.202

讨论

1965 年，MORE 从牛的大脑组织中首次分离出一种神经系统特异性蛋白混合物，因该类蛋白能够100%溶解在饱和硫酸铵（ammoniusulfate）中性溶液中，故称之为S100 蛋白[7]。S100A9 为相对分子质量较小（13×103）的蛋白，两端为氨基末端 EF-1 和羧基末端EF-2 手型结构，中间为铰链区，组成4 个α-螺旋，形成螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix)配基结构。羧基端结合位点常由12 个氨基酸组成，氨基端结合位点常由14 个氨基酸组成，呈环状结构。羧基端的Ca2+亲和力是氨基末端结合位点的100 多倍。S100A9 的羧基末端区域主要包括亲水的残基、甘油和脯氨酸残基，易变形和错乱，不能形成一个稳定的次级结构。S100A9 晶体结构包括4 个二聚体(DIM1、DIM2、DIM3、DIM4)。目前发现 S100 蛋白家族为小分子量蛋白组成的钙结合蛋白家族, 共有22 个成员，其中16 个成员定位于1 号染色体长臂2 区 1 带（1q21）[8]。

目前S100A9 分子蛋白研究发现广泛参与机体各方面调控，钙结合蛋白能够调节细胞内Ca2+浓度，从而调控细胞内信息调控，参与细胞生长、分化、凋亡。相关研究发现，S100A9 蛋白分子与机体肿瘤生长、分化及转移潜能具有关联性。Xiong TF、Wagner NB 等基础研究发现S100A9 蛋白和黑色素瘤侵袭性及转移相关，S100A9 分子蛋白检测有利于黑色素瘤早期筛查[9，10]。Raffat, MA 研究发现 S100 家族与OSCC（口腔鳞状细胞癌）具有相关性，可以成为OSCC筛查的潜在指标[11]。Arora A 等[12]发现重组S100A8/S100A9 蛋白可以促进整合素信号依赖性胶质瘤细胞迁移和侵袭。Hermani A 等[13]研究发现S100A8/A9诱导NF-NB 活化，p38 和 p44/42 磷酸化增加 MAP激酶，促使前列腺癌细胞转移。Laouedj M 等[14]研究发现S100A9 在急性髓性白血病（AML）存在高表达情况，S100A9 与 Toll 样受体 4（TLR4）的结合促进了p38 丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶1和2 以及Jun N 端激酶信号通路的激活，从而促进肿瘤细胞分化，对于肿瘤预后有重要影响。国内研究发现鼻咽癌病理组织及鼻咽癌不同分化鼻咽癌细胞S100A9 表达存在差异。S100A9 蛋白分子浓度能够促进CNE1、CNE2 细胞侵袭性及转移潜能[15]。李美香等[16]研究发S100A9 在NPC 间质中高表达与NPC的分化程度及淋巴转移具有相关性。本课题组曾发现鼻咽癌高癌家系外周淋巴细胞S100A9 存在差异性表达。同时也对鼻咽癌其他分子蛋白标记物进行筛查，发现 F-肌动蛋白 α 亚基（CAPZA1）、Prohibitin 蛋白在鼻咽癌高癌家系存在差异性表达[17，18]。

本次研究结果发现，在鼻咽癌高癌家系癌患者和散发性鼻咽癌癌患者mRNA 表达水平存在差异，但其P＞0.05，差异并不具有统计学意义。鼻咽癌高癌家系癌患者、散发性鼻咽癌癌患者、正常对照组S100A9 分子蛋白表达存在明显差异性，鼻咽癌高癌家系表达明显高于其他组，P＜0.05，差异具有统计学意义。相关结果表明S100A9 有望成为鼻咽癌高癌家系筛查指标。