基于网络药理学和分子对接法研究芫花抗炎作用机制

宗明月,张庆然,王璐琼,辛 敏,赵 烽

(烟台大学新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心、分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),山东 烟台 264005)

芫花(DaphnegenkwaSieb.et Zucc.)为瑞香科(Thymelaeaceae)植物,史载于《山海经》中山经,已广泛应用于中医临床超过2000年,主要分布于我国长江及黄河流域各省[1]。芫花含有多种化学成分,如黄酮类、木脂素类、香豆素类、瑞香烷型二萜类等[2],研究表明其药理活性主要包括抗肿瘤[3]、抗炎和免疫调节等[4]。

中药具有多靶点、多成分的特点,简单的药理学方法不能系统地揭示中药化学成分在体内的作用机制[5]。科学技术的发展、多学科的相互交叉为中药药效评价提供了高效、快速的方法。靶点筛选借助计算机模拟分析、生物信息学和分子网络数据等,从不同角度预测药物发挥药效的作用机制,成为药效评价体系不可缺少的一部分[6]。而计算机辅助药物设计具有直观、合理和便捷等特点,并逐渐成为中药与现代化进程连接的桥梁,其中分子对接[7]是通过模拟药物与受体大分子的相互作用,寻找与靶蛋白结合密切的候选化合物,可以进一步明确芫花中主要抗炎药效物质,并阐明其药理作用机制,优选主要抗炎化学成分及靶点蛋白,为芫花的药理作用及产品开发等提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 芫花活性成分的筛选和处理

TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/index.ph)数据库检索出芫花所含的化学成分共57个。根据药代动力学参数进行初步筛选[8],挑选出口服生物利用度(oral bioavailability, OB)大于30%,类药性(drug-likenesses, DL)大于0.18的化合物共14个组成化合物数据库,化合物名称及具体相关信息见表1。口服生物利用度是药物吸收、分布、代谢、排泄特性中尤为重要的参数之一,是表明药效分子及类药性的关键指数。类药性是指有良好的临床疗效药物的物理化学性质及生物学特性。在Chemdraw中绘制14个待对接化合物的平面结构,见图1。在SYBYL-X2.0中创建数据库,将这些化合物导入后进行能量最小化处理,使每个化合物有最稳定的构象,最后加入到创建的数据库中。

表1 芫花中所含有化学成分的相关信息

图1 芫花中14个化合物的结构

1.2 芫花活性成分作用靶点的筛选

从TCMSP数据库中筛选得到的14个化合物通过Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)[9]数据库进行靶标预测。PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中下载14个化合物的2D结构的SDF文件导入Swiss Target Prediction 数据库中, Organism选择Homo Sapiens,系统默认每个化学成分输出前15个靶标蛋白,包括蛋白名称、基因名称等信息。

1.3 芫花活性成分作用靶点KEGG通路富集

将药物疾病共有靶点进行KEGG通路富集分析,引用String(https://string-db.org/)数据库,得到靶标蛋白所参与的所有途径,筛选出与靶标蛋白显著参与的途径(P<0.05),使用R 3.6.3,安装并引用clusterProfiler包后,进行前20条通路的气泡图绘制,包括通路名称、富集因子、富集分析的P值等.

1.4 芫花活性成分与作用靶点的分子对接

采用分子对接软件SYBYL-X2.0中的Surflex-Dock模块完成分子对接研究。根据富集的通路结果,选取富集到基因数目最多的抗炎通路中潜在的靶点蛋白。本研究的靶点均从RSCB Protein Data Bank(https://www.rcsb.org/)数据库中获取。其中下载了fms related receptor tyrosine kinase 3(FLT3,PDB:6IL3)、spleen associated tyrosine kinase(SYK,PDBID:3FQH)、glycogen synthase kinase 3 beta(GSK3B,PDB: 3GB2)、insulin like growth factor 1 receptor(1GF1R,PDBID:3F5P)、epidermal growth factor receptor(EGFR,PDB: 3BEL)、kinase insert domain receptor(KDR,PDBID:2XIR)、erb-b2 receptor tyrosine kinase 2(ERBB2,PDB:3PP0)、interleukin 2(IL2,PDB:1M49)、phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha(PIK3CA,PDB:3ZIM)、phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit delta(PIK3CD,PDB:6PYR)、phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1(PIK3R1,PDB:4A55)、protein kinase C alpha(PRKCA,PDB:4RA4)、protein phosphatase 2 catalytic subunit alpha(PPP2CA,PDB:3P71)的晶体结构。蛋白晶体前处理及结合口袋的定义:提取原配体分子,删除水分子及其非相关的蛋白质构象,补充非完整的氨基酸残基,为蛋白加氢,以原配体分子位置为中心,选择半径5埃范围内为活性口袋,其他参数为默认值。

按默认参数进行分子对接后,分别得到每个化合物与各靶点蛋白的对接得分Score值, Score值越大,配体与受体结合越稳定。Score 值大于 5.0 表明化合物与靶点蛋白有较好的结合活性,大于 7.0 表明化合物与靶点蛋白的结合具有强烈的活性[10]。

1.5 芫花活性成分-靶点网络的构建

初步筛选得到的芫花活性成分(其中预测不到靶点以及筛选不到靶点的化合物不考虑)与选取的通路中的潜在靶标蛋白输入到Cytoscape3.7.2网络可视化软件中,构建成分-靶点(compound-target,C-T)网络,基于边数、节点、关联性设置颜色、大小。

1.6 芫花活性成分与靶点蛋白相互作用分析

LigPlot+是LigPlot的GUI界面化软件,是一款经典的配体与蛋白二维相互作用作图软件,可展示配体分子与受体蛋白之间的氢键、疏水等相互作用。本研究采用Ligplot 1.4.5 版本,将芫花活性成分与靶标蛋白Merg并且以PDB格式保存,导入软件中,自动计算形成的氢键、疏水作用。

2 结果与分析

2.1 芫花活性成分作用靶点KEGG通路分析

运用Swiss Target Prediction数据库筛选芫花活性成分的作用靶点蛋白,其中8号化合物羟光刺苞菊内酯未预测到靶点蛋白,其余13个化学成分共筛选出195个靶点蛋白,将重复出现的靶点蛋白删除,共筛选得到95个靶标蛋白,使用KEGG通路富集分析得到30条代谢途径。使用R 3.6.3,安装并引用clusterProfiler包后输出前20条显著通路,通路分析见图2。

颜色越红表示显著性越明显,气泡越大表示富集到的基因数目越多。

2.2 芫花活性成分与作用靶点的分子对接

20条通路中选择了富集到基因数目最多的抗炎通路:PI3K-Akt signaling pathway(P< 0.05)。PI3K-Akt通路包含14个靶点蛋白,其中protein phosphatase 2 regulatory subunit B'alpha(PPP2R5A)没有原配体,未深入研究。将芫花活性成分与PI3K-Akt通路中除PPP2R5A以外的13个靶点蛋白进行分子对接。使用对接结果中的Score 值的大小来评价配体与受体结合的稳定性,挑选出Score值等于或大于5的化合物。结果表明木犀草素、槲皮素、山萘酚、羟基芫花素、芫花素、龙胆山酮酚、7-羟基-6-甲氧基-3,7'-双香豆素、芫根苷、角鲨烯为芫花发挥抗炎作用的关键化学成分,对接总分大于65(表2)。

表2 活性成分与靶标蛋白分子对接打分结果

2.3 芫花活性成分-靶点网络的构建

初步筛选得到的芫花活性成分(其中预测不到靶点以及筛选不到靶点的化合物不考虑)与选取的通路中的潜在靶标蛋白输入到Cytoscape3.7.2网络可视化软件中,构建成分-靶点(compound-target,C-T)网络。根据度(degree)的大小筛选关键靶点及化学成分,整个网络中节点的大小与此节点的度呈正比,即与此节点相连的边越多,度越大,节点也就越大。如图3所示,EGFR、SYK、KDR芫花调节PI3K-Akt通路的关键靶标蛋白;木犀草素、山萘酚、羟基芫花素、槲皮素、龙胆山酮酚、芫花素等为芫花调节PI3K-Akt通路的关键化学成分,与分子对接结果一致。其中,圆圈代表关键靶点,菱形代表关键化学成分。

图3 化学成分-靶标网络模型

2.4 芫花活性成分与靶点蛋白相互作用分析

芫花中关键化学成分(Score>65)和epidermal growth factor receptor(EGFR)的相互作用分析结果见表3,结果显示木犀草素、槲皮素、山萘酚、羟基芫花素、芫花素与EGFR相互作用有很大的相似性,从表3中可以看出均与Met793、Gln791、Thr790、Lys745、Leu844、Ala743等氨基酸残基发生了相互作用,而且氨基酸残基相对位置相同,氨基酸类型相同(表3),推测这些残基就是epidermal growth factor receptor(EGFR)的关键氨基酸残基。

表3 关键化学成分与EGFR形成的氢键及疏水作用

3 讨 论

磷酸肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)是生长因子超家族信号传导过程中的重要分子, 可被多种细胞因子和理化因素激活,调节多种细胞功能[11]。磷酸化的 PI3K 可以通过PDK1/Akt途径激活 NF-κB并促进诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达,也可以通过Akt/mTOR途径促进 STAT3 的转录表达。抑制 PI3K 可以显著抑制 NF-κB的活化,进一步降低iNOS、COX-2、IL-6、IL-1β的表达,从而减轻炎症[12]。研究表明[13],PI3K及其下游靶标Akt的激活对于TNF-α诱导的NF-κB激活至关重要。本研究通过网络药理学以及分子对接相结合的方法筛选出芫花发挥抗炎的关键成分及靶点,通过相互作用进一步明确重要的氨基酸残基。结果表明,PI3K-Akt信号通路可能是芫花发挥抗炎作用的主要信号通路,木犀草素、槲皮素、山萘酚、羟基芫花素、芫花素等是芫花发挥抗炎作用的关键成分,EGFR、SYK、KDR是其发挥抗炎作用的主要靶点。EGFR 常在肿瘤细胞过表达,但该受体也广泛存在表皮细胞,可刺激表皮细胞生长,抑制其分化,抑制炎症并加速创面愈合。磷酸化的EGFR将胞外信号传入细胞内,激活下游一系列多功能化的信号通路,包括Ras/Raf/MEK/MAPK/JAK/STAT和PI3K/AKT,主要参与细胞的增殖、分化和存活[14]。王莉[15]通过动物实验发现,芫花具有良好的抗炎效果,芫花根总黄酮可能是通过抑制早期炎症因子IL-1β和TNF-α的分泌,以减少炎症因子PGE2、NO等晚期炎症因子的产生。越来越多的结果表明[16],植物化学成分(如木犀草素)可通过抑制PI3K/Akt途径减少内皮细胞的炎症反应。此外,亦有研究[17]证明槲皮素和山萘酚可以通过抑制脂多糖诱导的STAT-1和NF-κB通路的激活,以及iNOS的表达发挥抗炎作用。槲皮素在体外可有效抑制血管平滑肌细胞增殖,并抑制胶原的合成和分泌,其机制可能与槲皮素激活PI3K/Akt/NF-κB信号通路,上调磷酸化PI3K及Akt表达,进而抑制NF-κB向核内转运有关[18]。芫花素可以通过降低IKK、IκB和NF-κB的磷酸化水平来抑制NF-κB通路的激活,并下调iNOS、COX-2和IL-6 mRNA的表达水平发挥抗炎作用[19]。以上结果与本研究中网络药理学预测相互佐证。并且,本研究基于计算机辅助平台建立了芫花药理作用靶点快速筛选方法,相对于传统筛选,节约了大量时间和财力,同时为芫花药效评价提供新思路,为芫花细胞和动物实验提供理论支撑。更重要的是,在中药新药研究领域建立全新的理念和先进的研究手段,可为中药现代研究提供新思路和新方法。