树脂在中药多糖脱蛋白中的应用进展*

孙延平，刘 艳，杨炳友，王 蒙，王秋红，匡海学

（1.黑龙江中医药大学 教育部北药基础与应用研究重点实验室 黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨150040；2.中国科学院 大连化学物理研究所 药用资源开发实验室，辽宁 大连116023；3.广东药科大学 中药学院 中药炮制学教研室，广东 广州512000）

近20年来，由于中药中多糖类成分具有多方面的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、抗凝血、降血糖和免疫调节等，引起了医药学和化学界越来越多的关注和重视，中药多糖具有广阔的新药开发前景。然而，中药多糖大多是用水溶液提取获得，因而中药多糖被提取的过程中，同样是水溶性的蛋白质也被同时提取出来，干扰了后续多糖的结构和功能性质的测定。因此，多糖脱蛋白是中药多糖实际应用中首要解决的问题。近年来，树脂被广泛应用于天然产物中生物活性成分的纯化，树脂具有回收率高、选择性好、吸附条件温和、操作成本低、易于再生等优点，可以获得纯度较高的天然产物，为天然产物的研究提供了极大的便利。本文从树脂脱蛋白原理、影响因素及树脂在中药多糖脱蛋白中的应用两方面对近15年的文献报道进行总结，为实际中药多糖生产开发应用提供参考。

1 树脂脱蛋白原理及影响因素

1.1 树脂脱蛋白原理

大孔吸附树脂，是一种耐用性强的极性、非极性或微亲水性聚合物，具有很高的吸附能力。它可以通过静电作用、氢键作用、络合作用和分子筛作用选择性地吸附水和非水体系中的目标组分。因此，大孔吸附树脂被广泛应用于生物粗样品中目标成分与其它杂质的分离。与化学法相比，大孔吸附树脂作为粗多糖提取液的脱蛋白试剂具有操作成本低、溶剂消耗少、易再生等优点，能够不破坏多糖的结构和生物活性而同时去除粗多糖提取物中的蛋白质。

离子交换树脂，由于离子交换树脂对多糖的吸附性不强，而蛋白质是两性物质，可通过调节溶液pH值，使蛋白质处于离子状态，使其吸附性增大。例如：在碱性条件下蛋白以阴离子形式存在，吸附在阴离子树脂上；在酸性条件下其以阳离子形式存在，在阴离子树脂上的吸附性显著降低，因此，可通过改变酸度将蛋白质从阴离子树脂上洗脱下来。但当树脂的吸附能力降低时，须对树脂进行再生。

1.2 树脂对脱蛋白影响因素

大孔吸附树脂对于中药多糖的脱蛋白率有6大主要影响因素：

（1）pH值pH值通常通过改变多糖溶液中蛋白质和多糖的解离状态来影响树脂的吸附效率。

（2）温度 吸附温度是影响树脂法脱蛋白效果的重要因素。升高温度可以使溶质分子的热运动增加，有利于蛋白质的吸附，但升到一定温度下，吸附会达到饱和。因此，要选择合适的吸附温度。

（3）处理间 延长吸附时间可以提高树脂对蛋白质的吸附，从而提高其脱蛋白率。然而，较长的吸附时间也会导致多糖的损失。

（4）树脂用量 很明显，树脂柱的高径比代表了树脂柱床体积，随着体积的增大，树脂与蛋白质的交换能力增加，但交换能力最终会达到饱和。

（5）多糖溶液浓度 当多糖溶液浓度增大时，树脂吸附会达到饱和。

（6）流速 随着流速的增加，脱蛋白率会逐渐降低，缓慢的流速有利于蛋白在树脂上的颗粒扩散和膜扩散，从而与树脂进行离子交换。另外，近15年来诸多学者采用了多种不同的树脂材料对中药多糖脱蛋白效果进行测试（部分树脂物理结构参数见表1），结果表明，每种树脂材料的物理性质和化学吸附性质也同时决定了脱蛋白效率。

表1 部分树脂的物理结构参数Tab.1 Physical structure parameters of part of resins

2 树脂在中药多糖脱蛋白中的应用

2.1 植物多糖

2.1.1 根及根茎类多糖 丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza的干燥根和根茎，丹参多糖具有免疫增强作用，汤伟等人[1]为了精制丹参多糖去除蛋白，对4种大孔吸附树脂纯化多糖效能进行了比较，筛选出DB-301型树脂脱蛋白效果较好，脱蛋白率高达97.90%，而且多糖纯度可达80%左右。人参为参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎，人参多糖可抗肿瘤，其增强免疫功能较强，陈巧巧等人[2]用静态吸附去除人参多糖中蛋白质，从5种树脂中筛选出JK008型阳离子交换树脂最为有效，在此基础上优化了动态吸附条件如下：上柱重量（药材∶干树脂）设置为1∶1，直径高度比设置为1∶7，洗脱量为3BV。最终可使蛋白脱除率达到84.38%，糖醛酸保留率为84.90%。西洋参为五加科植物西洋参Panax quinquefolium的干燥根，西洋参多糖具有抗炎、免疫调节等多种活性，Yu等人[3]在分离纯化西洋参多糖的过程中，将10mg·mL-1的西洋参多糖溶液经聚酰胺树脂柱色谱（20g）（Φ16mm×300mm）洗脱，蛋白去除率为95.42%，多糖损失率为10.86%，结果显示，聚酰胺树脂柱法优于其它3种除蛋白方法Sevag法、TCA法和木瓜蛋白酶法。恰玛古为Brassica rapa维族医药常用中药，主要药用部位为肉质块根，具有滋阴润肺等功效，陈卓尔等人[4]通过静态吸附和动态吸附对比和筛选了9种树脂对恰玛古粗多糖的脱色脱蛋白作用，结果表明，采用HPD500型树脂，多糖浓度1%，以流速3.6BV·h-1进行洗脱，0.75BV为上样量，多糖保留率、脱色率、蛋白质脱除率3项综合评分相对较高。

2.1.2 茎类多糖 红心火龙果茎为仙人掌科量天尺属植物哥斯达黎加量天尺Hylocereus costaricensis的茎，火龙果茎多糖，具有美白等多种活性，马若影等人[5]经6种树脂的筛选，认为其中AB-8型树脂对红心火龙果茎多糖的蛋白去除效果最佳，以树脂的用量0.6g·mL-1，温度60℃，pH值为5及时间2h为条件，脱蛋白最优，去除率可达88.29%，此时多糖保留率为83.47%。Shi等人[6]应用一种含有α-氨基膦酸盐基团的Zn2+金属离子熬合树脂（LKC100型树脂），对香蒲科植物水浊香蒲Typha angustifolia L.假茎多糖中的蛋白进行去除，吸附洗脱条件为：粗多糖浓度1.5mg·mL-1，吸附时间30min，初始pH值为7.0，吸附温度30℃，流速1.5BV·h-1，树脂柱的径高比为1∶15。此条件下，香蒲多糖中蛋白去除率和多糖保留率分别为（69.20±0.62）%和（87.50±0.76）%。

2.1.3 叶类多糖 枇杷叶为蔷薇科植物枇杷Eriobotrya japonica的干燥叶，近期研究表明，枇杷叶多糖具有抗氧化作用，戴婉妹等人[7]从6种树脂中筛选出ADS-7型树脂去除枇杷叶多糖中的蛋白最佳，采用10%乙醇洗脱回收多糖，此条件下多糖的解析率为69.65%，再用95%乙醇洗脱蛋白质，蛋白解析率为89.58%，此外，此方法还可将ADS-7型树脂再生利用。普洱茶为山茶科植物普洱茶Camellia sinensis的叶，普洱茶多糖具有增强免疫、降血糖、降血脂等功能，杨新河等人[8]筛选了10种树脂，其中D101型树脂对普洱茶多糖中色素和蛋白质的吸附能力较强，经静态吸附单因素试验和正交试验，4因素最佳条件为：温度50℃、树脂用量11mL、pH值为4.0、料液质量浓度3.8mg·mL-1。此条件普洱茶多糖中蛋白去除率可达70.89%。淫羊藿为小檗科植物淫羊蕾Epimedium brevicornu的干燥叶，淫羊藿多糖被发现有改善小鼠学习记忆障碍的作用，李瑞军等人[9]从淫羊藿多糖中蛋白去除效果上，ADS-7型树脂明显优于其他3种大孔吸附树脂，淫羊藿粗多糖溶液为18.59mg·mL-1，pH值为5.0，v=1.5BV，洗脱体积控制在2倍柱体积，该方法具有较高的去除效率，蛋白含量由1.2%下降到0.035%。

2.1.4 果实类多糖 无梗五加为五加科五加属植物Eleutherococcus sessiliflorus的果实，无梗五加果多糖具有抗疲劳等多种药理活性，冯颖等人[10]为了脱除无梗五加果粗多糖中蛋白，考察了4种大孔吸附树脂，认为HPD-400型树脂优于其他3种，且当条件设置为上样量和洗脱剂用量均为2个柱床体积（20mL）时，HPD-400型树脂蛋白去除率可达89.37%，多糖含量由原来的20.5%提高到83%。现代研究表明，无患子科植物龙眼Dimocarpus longan多糖具有抗氧化、保肝等功能，易阳等人[11]从两种阴离子交换树脂和6种大孔吸附树脂筛选出阴离子交换树脂D301-F型树脂，对龙眼多糖中蛋白的去除效果最好，多糖溶液质量分数4%，料液比0.16g·mL-1，pH值为5，温度为50℃，此时蛋白质去除率为73.12%，多糖保留率为85.75%。蓝海波等人[12]考察了7种树脂，结果表明，D301-R型树脂在温度为48℃，pH值为5.0，树脂用量为0.61g·mL-1及时间为2.0h的条件下，龙眼多糖蛋白去除率为91.83%，明显优于其他6种树脂。

2.1.5 种子类多糖 银杏果是银杏科植物银杏（Ginkgo biloba）种子，杨强等人[13]从6种大孔吸附树脂和两种离子交换树脂筛出脱色1号树脂对银杏果多糖的脱蛋白效果最好，在最优的条件下（pH值为4.5，温度为25℃，上柱速度为1.5mL·min-1，上样浓度为4mg·mL-1，柱容量为2BV），蛋白去除率为88.39%，多糖保留率为79.12%。状元豆为豆目蝶形花亚科大莱豆Phaseolus limensis，具有祛湿、补血等功效，黎英等人[14]从10种树脂中，筛选出D113型树脂对状元豆粗多糖除蛋白效果最佳，在室温25℃下，上样浓度为4.1mg·mL-1，pH值为5.5，流速为1.6mL·min-1，上样体积为2.9BV时，蛋白去除率和多糖保留率分别达（90.24±0.87）%和（94.07±1.15）%。使用后用30%乙醇洗脱液洗脱可让树脂再生。

2.1.6 花类多糖 款冬花为菊科植物款冬Tussilago farfara的干燥花蕾，款冬花多糖可抑制白血病细胞，Zhao等人[15]静态吸附实验考察5种树脂，LS-206型树脂对款冬花多糖的脱色率高于其他树脂，再通过动态吸附曲线，25℃温度下，流速1.5BV·h-1，5mg·mL-1款冬花多糖用量为2BV，在此条件下，款冬花多糖的蛋白去除率为91.42%，多糖回收率为85.38%。宋逍等人[16]通过静态试验从5种树脂中再次确定LS-206型树脂对款冬花多糖脱除蛋白效果最好，动态吸附条件为：上柱高径比15，温度30℃，上柱体积2BV，多糖溶液浓度6mg·mL-1，上柱速率1.5BV·h-1。此条件下的款冬花多糖的脱蛋白率为87.70%，多糖保留率为87.89%。金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica的干燥花蕾或带初开的花，金银花多糖具有抗菌等活性，何俊婷[17]为了对金银花多糖进行纯化脱除杂质，对比7种大孔吸附树脂，并最终筛选出LS-206型树脂进行除杂，上样浓度为3mg·mL-1，上样量为1.4BV，流速设置为1.5BV·h-1，在此条件下，金银花多糖脱蛋白率为83.83%，多糖保留率为81.29%。

2.1.7 皮类多糖 厚朴为木兰科植物厚朴或凹叶厚朴Magnolia officinalis的干燥干皮、根皮及枝皮，厚朴多糖具有一定抗抑郁活性，蓝闽波等人[18]从6种大孔吸附树脂中，通过静态吸附法筛选出ADS-7型大孔树脂对厚朴多糖的效果最佳，ADS-7属强极性树脂，对0.1%厚朴粗多糖的脱蛋白率能达到91%。

2.1.8 全草类多糖 二色补血草为白花丹科植物二色补血草Limonium bicolor的带根全草，二色补血草多糖可抑制hela细胞体外生长，Zhang等人[19]为了去除二色补血草多糖中的蛋白，从5种不同树脂中筛选出LX-46型树脂效果最好，经进一步条件优化，各参数设置为：流速1.5BV·h-1，上样量2BV，室温下多糖样品溶液浓度6mg·mL-1，此条件下，蛋白去除率达92.79%，同时多糖的保留率为86.53%。

2.1.9 残渣及压榨物类多糖 葫芦科植物南瓜Cucurbita moschata多糖具有体外抑菌等活性，Yang等人[20]比较了6种不同极性、直径和表面的树脂，对南瓜多糖溶液进行脱蛋白试验，筛选出S-8型树脂效果最好，经动态吸附和解吸测试，S-8型树脂最佳吸附条件为：粗多糖溶液浓度1mg·mL-1；处理量2BV；流速1mL·min-1；温度20℃。S-8型树脂最佳解吸条件：8BV的NaCl溶液（50mM，pH值7.0）和8BV的乙醇-水（70∶30，v/v）作为洗脱液，流速为1mL·min-1。此条件下，脱蛋白率为（75.9±0.9）%，多糖保留率为（84.7±1.2A）%，综合效用优于H2O2和Sevage试剂法。紫苏子为唇形科植物紫苏Perilla frutescens的干燥成熟果实，紫苏籽制取紫苏籽油后的主要加工副产物即为紫苏粕，紫苏粕多糖具有抗氧化活性，朱建飞等人[21]通过静态吸附测试，认为D101型树脂优于其他7种大孔吸附树脂，可以使紫苏粕多糖提取液的脱蛋白效果最大，动态吸附试验显示D101型树脂动态吸附中对于多糖的回收率为88.43%，高于其他树脂。

2.2 菌类多糖

香菇为真菌类担子菌纲伞菌目伞菌科香蕈Lentinus edodes，以子实体入药，具有抗肿瘤等功效，肖静怡等人[22]对香菇多糖的脱蛋白效果进行了考察，筛选了717型阴离子树脂、JK008型阳离子树脂和AB-8型大孔树脂3种类型树脂，其中脱蛋白效率JK008型＞717型＞AB-8型，阳离子交换树脂JK008可使香菇多糖脱蛋白率达到86.5%，多糖的保留率达到85%，且条件温和。桑黄为多孔菌科植物针层孔Phellinus igniarius的子实体，可显著提高人体免疫，秦俊哲和张慧洋[23]通过静态吸附筛选出D-101-I型树脂去除桑黄粗多糖的蛋白最好，优于其他4种大孔吸附树脂，动态吸附实验确定最佳条件为：室温下，多糖液浓度300mg·mL-1，流速1mL·min-1，上样量为2BV时蛋白的吸附率达90%；乙醇浓度为50%，用量为2BV时，蛋白脱除率达83.9%，多糖损失率为25.1%。赤灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum的干燥子实体，赤灵芝多糖具有抗肿瘤、抗炎、抗疱疹等多种生物活性，Jiang等人[24]从不同类型的离子交换树脂中，综合考虑对赤灵芝多糖蛋白的去除率和赤灵芝多糖的回收率，最终筛选出A103S型阴离子交换树脂效果最佳，经过响应面法优化各因素水平，确定最优条件为：样品浓度10mg·mL-1，样品体积100mL，样品流速2mL·min-1，洗脱流速40mL·min-1。此条件测试结果，赤灵芝多糖蛋白去除率和多糖回收率为88.52%和85.06%。

2.3 其他类多糖

虫白蜡为介壳虫科昆虫白蜡虫Ericerus pela的雄虫，群栖于木犀科植物白蜡树、女贞或女贞属他种植物枝干上分泌的蜡精制而成，虫白蜡多糖具有抗氧化免疫等功效，何钊等人[25]从12种不同结构参数的大孔吸附树脂中，优选筛出NKA-9型树脂对于虫白蜡多糖中蛋白的去除率最好，吸附条件优化为pH值为8.0，温度为30℃，虫白蜡多糖溶液浓度为10mg·mL-1，以1BV·h-1流速上样1BV后，以5BV水洗脱，此时脱蛋白率为51.9%、多糖回收率为60%。

3 结论

到目前为止，多糖脱蛋白技术已被学术界广泛研究，采用了除树脂外的多种方法，包括广泛使用的Sevag法、三氯乙酸法、冻融（FTT）法。然而，Sevag法和三氯乙酸法都是化学试剂，有毒且难以放大，并且需要复杂和多步骤的过程，导致脱蛋白率低，多糖损失大，甚至可能降低多糖的生物活性。虽然冻融脱蛋白无毒，但需要耗费时间和热量。然而，树脂脱蛋白法保留了多糖的特征官能团、单糖组成和分子量。重要的是，树脂脱蛋白不消耗任何有毒的有机试剂。树脂是一种对环境友好的多糖脱蛋白方法，有望在未来取代常用的Sevag法等传统方法，而被广泛应用。