透明细胞肾细胞癌组织中miR-4313、TBX15的表达及临床意义

苏 计 王 刚 冯世伟

辽宁省本溪市中心医院泌尿外科，辽宁本溪 117000

透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是泌尿系统常见的恶性肿瘤，我国每年新发病例约6.8万例，发病率为4.99/10万[1-2]。ccRCC患者早期无明显临床表现，发现时已出现转移，丧失手术价值，生存预后不佳[3-5]。因此，深入研究ccRCC发生发展机制，具有较大临床价值。微小RNA（miR）-4313编码基因位于9q31.3，与细胞增殖、发育、分化及代谢等过程密切相关[6]。研究发现，miR-4313可调控细胞内多条信号传导通路，在肾癌[7]、粒细胞白血病[8]等肿瘤中异常表达下调，其能通过抑制肿瘤细胞的增殖、迁移及浸润等，发挥抑癌基因的功能。T-box转录因子15（TBX15）基因位于1p12，此基因属于T-box基因家族，其编码调控各种发育过程中的保守的转录因子。研究表明，甲状腺癌[9]、前列腺癌[10]等肿瘤中TBX15异常表达升高，并能通过抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤的发生发展。本研究通过检测ccRCC癌组织中miR-4313及TBX15基因表达，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年3月—2019年12月辽宁省本溪市中心医院（以下简称“我院”）诊治并行手术治疗的ccRCC患者93例。纳入标准：①均为首次发现；②病理学检查明确诊断为ccRCC；③能够配合相关检查和治疗。排除标准：①泌尿系统感染、结核等疾病；②合并慢性肾病、肾功能不全；③合并肿瘤性疾病或免疫系统疾病；④以往有抗肿瘤治疗史。93例ccRCC患者中男51例，女42例；年龄35～75岁，平均（46.7±7.2）岁；病理分级：高分化35例，中低分化58例；肿瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期64例，Ⅲ～Ⅳ期29例；伴远处转移21例，无远处转移72例；伴淋巴结转移17例，无淋巴结转移76例。患者对本研究均知情同意并签署知情同意书，本研究经我院医学伦理委员会审核批准。

1.2 荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测癌组织及癌旁组织中miR-4313及TBX15 mRNA表达

将癌组织及癌旁正常组织（距癌组织3 cm以上）剪碎后冰上研磨，加2 mL Trizol重悬。Trizol法提取组织中的RNA。以RNA作为模板，将RNA反转录为cDNA，Narodrop检测cDNA浓度及纯度，OD260/OD280比值介于1.8～2.1之间，-20℃保存。miR-4313正向引物序列：5’-GAAAGCCCCCTGGCCC-3’，反向引物序列：5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’；以U6为内参，正向引物序列：5’-CGACAAGACGATCCGGGT-AAA-3’，反向引物序列：5’-GGTTGAGGAGTGGGT-CGAAG-3’；TBX15正向引物序列：5’-TGACCTCTG GAAGCGGTTC-3’，反向引物序列5’-GATGTG GATCTAGGCCAGTGA-3’；以GAPDH为内参，正向引物序列：5’-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3’，反向引物序列：5’-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3’。qRT-PCR总体系20 μL，包括Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。TBX15反应条件为：95℃4 min，95℃30 s，65℃30 s，72℃30 s，共35个循环。miR-4313反应条件为：95℃30 s，95℃5 s，62℃30 s，70℃20 s，共45个循环。miR-4313及TBX15 mRNA的相对表达量以2-ΔΔCt值法表示，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。

1.3 免疫组织化学法检测组织中TBX15蛋白表达

将石蜡包埋的组织样本切片，切片厚度4 μm，70℃烤2 h；二甲苯脱蜡2次；梯度乙醇水化；高压锅法抗原热修复；3%双氧水去除内源性过氧化物酶；5%羊血清封闭；一抗4℃孵育过夜（购自Abcam公司，货号：ab134916）；二抗（山羊抗兔IgG-HRP购自北京博奥易杰公司，货号：BE0101）孵育2 h；DAB显色；梯度脱水，封片镜检。结果判定：根据阳性表达部位的染色强度及染色面积对蛋白表达进行评估。不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，深褐色为3分。面积＜25%为1分，25%～50%为2分，＞50%为3分。以染色强度评分与阳性细胞数评分的乘积计算结果。0～2分判定为阴性，3～9分为阳性。每个切片在200倍镜下随机选取5个视野，结果取平均值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。miR-4313与TBX15表达的相关性采用Pearson线性相关分析。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ccRCC癌组织及癌旁组织中miR-4313、TBX15 mRNA表达比较

癌组织miR-4313相对表达量明显低于癌旁组织，而TBX15 mRNA的相对表达量明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表1。

表1 ccRCC癌组织及癌旁组织中miR-4313、TBX15 mRNA表达比较（）

表1 ccRCC癌组织及癌旁组织中miR-4313、TBX15 mRNA表达比较（）

注：ccRCC：透明细胞肾细胞癌；miR：微小RNA；TBX15：T-box转录因子15

2.2 ccRCC癌组织及癌旁组织中TBX15蛋白表达

癌组织中TBX15蛋白主要表达于细胞浆及细胞核。ccRCC癌组织及癌旁组织中TBX15蛋白表达阳性率分别为86.02%（80/93）、23.7%（22/93）。癌组织中TBX15蛋白表达阳性率明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（χ2=73.028，P ＜0.001）。ccRCC癌组织及癌旁组织中TBX15蛋白表达见图1（封三）。

图1 ccRCC癌组织及癌旁组织中TBX15蛋白表达（免疫组化，200×）

2.3 ccRCC癌组织中miR-4313、TBX15蛋白表达与临床病理参数的关系

癌组织中miR-4313、TBX15蛋白在患者不同年龄、性别、病理分级、远处转移及淋巴结转移中表达比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ期ccRCC癌组织中miR-4313表达明显低于Ⅰ～Ⅱ期癌组织，差异有统计学意义（P ＜0.05）。肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ期ccRCC癌组织中TBX15蛋白表达阳性率明显高于Ⅰ～Ⅱ期癌组织（P ＜0.05）。见表2。

表2 ccRCC癌组织中miR-4313、TBX15蛋白表达与临床病理参数的关系

2.4 ccRCC癌组织中miR-4313、TBX15 mRNA表达的相关性

应用Pearson线性相关分析ccRCC癌组织中miR-4313与TBX15 mRNA表达的相关性，结果显示，癌组织中miR-4313与TBX15 mRNA表达呈显著负相关（r=-0.671，P=0.001）。

3 讨论

miR-4313是近年来新发现的miRNA分子，编码基因位于人类15号染色体。miR-4313的生物学功能尚不清楚，但有学者研究表明，miR-4313在恶性肿瘤、主动脉夹层等疾病中发挥重要的生物学调控功能，其能够配对结合下游靶基因mRNA的3’非编码区，降低mRNA的稳定性，抑制下游靶基因的表达，进而导致疾病进展[11-12]。本研究中，ccRCC癌组织中miR-4313表达较低，可能与基因启动子的异常甲基化有关。有研究表明，肿瘤中miRNA，如miR-17、miR-4313等的启动子区域存在异常高甲基化的现象，导致miRNA转录水平降低[13-15]。此外，ccRCC癌组织中miR-4313的表达与肿瘤分期有关，提示miR-4313的低表达参与促进ccRCC的恶性进展。有学者证实，miR-4313参与调控多种癌基因表达，肿瘤发生时miR-4313表达水平降低，导致下游靶基因同源框蛋白1表达水平升高，激活AKT信号通路，促进肿瘤的恶性进展[6,16]。

TBX15是保守的T-box基因家族的成员，该家族成员对于骨骼发育、分化等多种生物学过程都是必不可少的，如TBX15基因突变可导致颅面和骨骼缺损及骨盆性髋臼症[17-20]。有研究表明，肝癌等肿瘤中TBX15基因的异常高表达能够促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，诱导肿瘤细胞发生浸润和转移，还可促进肿瘤细胞的增殖，抑制其凋亡，是肿瘤诊断及治疗的重要分子标志物[21-22]。本研究中，ccRCC癌组织中TBX15表达升高。其机制可能是肿瘤微环境中肿瘤坏死因子α 表达水平升高，激活肿瘤中NF-κB信号通路，NF-κB能够直接结合到TBX15基因的启动子区，促进TBX15基因的表达[9]。此外，TBX15还受到miRNA的表达调控。有研究报道，miR-212、miR-451等能够直接结合并抑制TBX15 mRNA的表达，而肿瘤发生时miR-212的表达水平显著降低，导致TBX15的表达上调[23-24]。本研究亦显示，TBX15蛋白表达与肿瘤分期有关，可能是肿瘤发生时TBX15的表达增加促进肿瘤细胞发生凋亡逃逸。有学者报道，TBX15作为一种T-box转录因子，肿瘤中TBX15表达水平升高能够诱导抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调，而促凋亡蛋白Bax表达下调，引起肿瘤细胞凋亡减少，肿瘤细胞增殖过度，导致肿瘤分期升高[9,24-25]。本研究中，ccRCC癌组织中miR-4313与TBX15 mRNA表达呈显著负相关。其原因可能是肿瘤中miR-4313表达降低后，结合到TBX15 mRNA 3’ 非编码区的能力降低，TBX15 mRNA稳定性增加，导致TBX15表达水平上调[22]。因此，miR-4313/TBX15可能是影响ccRCC发生发展过程重要机制。

ccRCC癌组织中miR-4313表达降低，而TBX15 mRNA及蛋白表达升高，miR-4313与TBX15 mRNA表达之间呈显著负相关。miR-4313及TBX15蛋白表达与肿瘤分期有关，两者均参与ccRCC的发生发展，可能成为新的ccRCC早期诊断及治疗的分子标志物。但两者之间的具体作用机制及临床意义有待大样本深入研究。