基于网络药理学和分子对接探讨清热卡森颗粒治疗肾性水肿的分子机制

段艳芬 张东宁 侯帅红 莫国艳 韩林涛 黄 芳 尹 强, 李晶晶

1.湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065；2.新疆维吾尔药业有限责任公司，新疆乌鲁木齐 830026；3.湖北中医药大学基础医学院，湖北武汉 430065

清热卡森颗粒是由菊苣加工制成的单味制剂，其具有利尿、消水肿的作用，用于治疗湿热黄疸、胃痛食少、水肿少尿等症状，菊苣同时具有润肠通便、健胃、利尿和促进伤口愈合效果[1-3]。肾性水肿常由肾病综合征、急性和慢性肾炎、急性和慢性肾功能不全等肾疾病引起，首先发生在机体松散组织，进而发展至脚踝和下肢，直至全身，甚至腹水[4]。该病易复发，可导致蛋白尿、血尿、高血压病等系统损伤[5]，一般使用西药利尿剂治疗，但一些特发性水肿患者长期服用利尿剂呋塞米反而会增加水肿，即出现药物诱导性水肿[6]。因此探索新的利尿药物尤为重要，菊苣利水消肿的作用在维吾尔族医学中应用广泛，但其治疗肾性水肿的作用机制和靶点尚不清楚。本研究采用网络药理学方法和分子对接技术探讨清热卡森颗粒治疗肾性水肿可能的作用机制，为肾性水肿的治疗研究提供新思路。网络药理学打破以往单组分、单靶点的概念[7]。分子对接常用于药理研究中探索新的疾病治疗靶点。本研究采用SwissADME中的参数对清热卡森颗粒的化学成分进行筛选，利用分子对接技术揭示清热卡森颗粒的有效成分与肾性水肿的治疗靶基因复杂的网络关系，解释清热卡森颗粒的多组分、多靶点、多路径的作用机制[8-10]。

1 资料与方法

1.1 清热卡森颗粒活性成分筛选

从中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）[11]和相关文献[12-13]中查找清热卡森颗粒化学成分，采用PubChem数据库搜索成分，保存SMILES结构。导入SwissADME中得到药物的相关参数，其中GI absorption代表胃肠道吸收和大脑进入，是两种药代动力学行为，在药物发现过程的不同阶段其对药物评估至关重要[14]。Lipinski规则可以比较准确地预测化合物的吸收或渗透性能，其中有关亲脂性的规则可以评估类药性[15-16]。本研究以GI absorption=High、Lipinski规则违反次数≤0为条件参数筛选得到其有效成分。

1.2 清热卡森颗粒化合物靶点筛选

根据Swiss数据库，选取结果中probability ＞0的靶标进行分析。

1.3 清热卡森颗粒治疗肾性水肿靶点筛选及其网络构建

在疾病数据库GeneCards、Malacards、OMIM中，通过关键词“Renal edema”合并去重后获得疾病靶点。

1.4 基因功能与途径分析

运用R语言进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析清热卡森颗粒治疗肾性水肿的作用机制。以P ＜0.05，FDR＜0.05为差异有统计学意义。

1.5 活性成分-靶点基因-富集通路网络图

将活性成分、靶点基因和富集通路导入Cytoscape 3.7.0软件，构建三者的网络图。

1.6 分子对接验证

利用Cytoscape 3.7.0中CentiScape插件计算度值（Degree），选取Degree排名前10位的靶点与化合物，分别利用AutoDockTools 1.5.6进行分子对接验证。采用PyMOL软件对蛋白质结构和活性成分进行修饰，在相同条件下进行分子对接实验，获得可能与靶蛋白结合并发挥药理作用的有效成分。一般认为，分子对接结合能的绝对值＞4.25说明具有一定的结合活性，对接结合能绝对值＞5.0说明结合活性较好，对接结合能绝对值＞7.0说明具有很强烈的结合活性[17-18]。

2 结果

2.1 清热卡森颗粒活性成分筛选

结合数据库与文献检索初步筛选出35个活性成分。SwissADME筛选结果表明这35种化合物在体内效果较好，主要为黄酮类、萜类、苯丙素类等。35种化合物过滤条件的SwissADME参数见表1。

表1 清热卡森颗粒活性成分基本信息

2.2 潜在目标筛选

在疾病数据库中合并去重后获得1397个与疾病有关的基因，其中有153个治疗肾性水肿的潜在靶基因。

2.3 基因功能与途径分析

利用R语言3.6.1和Bioconductor等数据包提取信息，设定阈值P ＜0.05，FDR＜0.05，GO富集分析结果见图1（封三）。KEGG途径注释显示，153个潜在靶基因中有150个（98.0%）富集，涉及155条途径，基因显著富集在PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路等。见图2（封三）。

图1 清热卡森颗粒治疗肾性水肿的GO富集

图2 清热卡森颗粒治疗肾性水肿的KEGG通路富集

2.4 化合物-靶点-通路网络图

将筛选得到的35个活性成分、153个靶点基因和KEGG通路分析的前12条相关途径导入Cytoscape 3.7.0软件中构建活性成分-靶点基因-富集通路网络图，图中共有200个节点（活性成分35个，靶点153个，通路12个）。图中最外圈圆形代表通路，最内圈的圆形代表活性成分，其他代表靶点。见图3。

图3 活性成分-靶基因-富集途径网络图

2.5 分子对接验证

根据Degree排名前10的靶点有EGFR、KDR、MAPK3、IGF1R、AKT1、GSK3B、MAPK1、PRKCA、SRC、MMP9。排名前8的化合物有毒扁豆胺碱、木兰素A、山莴苣素、秦皮乙素、11β，13-二氢山莴苣素、良姜素、槲皮素、11β，13-二氢山莴苣苦素。靶点与化合物的分子对接结合能打分的绝对值结果显示，筛选得到的活性成分与靶点的对接结合能均具有较好的活性。见图4（封四）。

图4 核心靶点与化合物的分子对接结合能打分热图

3 讨论

本研究发现菊苣即清热卡森颗粒中萜类化合物活性最强，其次是黄酮类化合物，其活性成分山莴苣素、秦皮乙素、槲皮素等富集程度较高。根据Degree值可知EGFR、KDR、MAPK3、IGF1R、AKT1、GSK3B等为清热卡森颗粒治疗肾性水肿的重要靶点。有研究表明菊苣包含苦味物质秦皮乙素，具有镇痛、利尿、促进尿酸排泄的作用[19]。山莴苣苦素在菊苣中含量较高，特异性强，其保肝作用主要与倍半萜内酯成分有关，且具有抗疟疾的作用[20]。Wesołowska等[21]研究报道，前列腺素E2（PEG2）能增强疼痛反应和水肿，而8-去氧山莴苣素、山莴苣素、山莴苣苦素等化合物可使PEG2减少，减轻水肿。黄酮类化合物槲皮素、木犀草素属于黄嘌呤氧化酶抑制剂的非嘌呤类似物[22]。有文献研究[23]提示，槲皮素可能是潜在的预防炎症性肾损伤的治疗物质，此外，槲皮素能抑制M2巨噬细胞的极化，从而减少肾纤维化。通过KEEG富集分析发现，清热卡森颗粒治疗肾性水肿的作用主要与PI3K-Akt、MAPK、Ras、Rap1等信号通路密切相关。其中PI3K-Akt靶基因数目最多，PI3K-Akt信号通路在肾纤维化的过程中起重要作用，还参与降低肾细胞外基质的堆积，以及抑制肾恶性肿瘤患者病情的恶化[24-25]。MAPK等信号通路，如细胞外信号调节激酶途径等是参与肾纤维化的重要信号通路[26]。Ras及Rap1信号通路能够介导肾小球炎症损伤[27-28]。Rap1信号通路与肾纤维化靶标相关的数量较多，具有多种合作途径，能够调节肾纤维化的进程，参与细胞凋亡和炎症等[29]。本研究在分子对接过程中，选取排名靠前的8个有效成分化合物与核心靶蛋白进行对接，结合能均为负值，提示模型对接效果好，进而证明网络药理学预测结果可靠、准确。清热卡森颗粒可能通过EGFR、KDR、MAPK3、IGF1R、AKT1、GSK3B等靶点来干预肾性水肿及其并发的炎症反应，预防炎症性肾损伤，减少肾纤维化，维系肾脏滤过屏障。本研究仍具有一定的局限性，如探究清热卡森颗粒治疗肾性水肿的详细作用后期需进一步对菊苣潜在活性成分、作用靶点及通路进行免疫印迹试验和PCR技术等实验验证。本研究基于网络药理学和分子对接，提示清热卡森颗粒可通过多成分、多靶点、多通路的形式来治疗肾性水肿，为临床研究提供依据。