魔芋软腐病pelD和pelE基因的克隆与表达分析

陈恩发，刘 辉，丁海兵，潘 牧，王启富

(贵州省农业科学院 生物技术研究所，贵州 贵阳 550006)

【研究意义】研究魔芋软腐病病原菌的致病机理，对进一步探明该病原菌的侵染过程和该病的防治提供理论依据。【前人研究进展】魔芋(Konjac)为天南星科魔芋属多年生草本植物，在我国南部地区广泛种植。魔芋含有丰富的葡甘聚糖，因其具有保水性、成膜性、胶凝性、乳化性、稳定性等良好的特性，被广泛地应用于食品、农业、环保、医药、化工、生物等领域[1-2]。近年来，随着魔芋种植面积的不断扩大，各种病害便随之发生，且日渐严重，严重制约了魔芋产业的发展。魔芋软腐病是危害魔芋生产的主要病害之一[3]，发病率高，死亡率大且极易传染，常大面积、连片爆发，给魔芋产业带来毁灭性打击，极度增加了农民的种植风险[4]。刘佩瑛等[5]研究发现，魔芋软腐病是由胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜软腐亚种(Eriwiniacarotovorapv.carotovora)侵染所致。修建华等[6]将软腐病菌株分为3个组群，分别为菊欧文氏杆菌(Erwiniachrysanthemi,E.ch.)、胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜软腐亚种(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora,E.c.c.)和一组尚不能确定的菌株。魔芋感染软腐病菌后，叶片或块茎变软、倒伏、发黑腐烂，并带有刺激的酒臭味[7]。胡萝卜软腐欧文氏菌致病因子主要依赖其分泌的植物细胞壁降解酶，包括果胶酶、纤维素酶、以及多种蛋白水解酶等[8]。其中，果胶酶是致病过程中的主要致病因子，果胶酶是一种以多种形式存在的同功酶，由果胶酸盐裂解酶(pel)、果胶甲基酯酶(pme)、果胶质裂解酶(pnl)、聚半乳糖醛酸酶等组成，有不同的基因编码，并成簇排列。果胶酸盐裂解酶(pel)是果胶酶中最重要的酶，由5个主要果胶裂解酶和至少3个次要果胶裂解酶组成[9]。在病原菌侵染的不同时期均有果胶酶基因的表达[10]，有研究表明，果胶酶基因通过与一些基因的协同作用，可使病原菌穿透植物组织的能力提高，加速植物细胞壁的降解，使细胞壁成分被释放出来为病原菌提供营养[11]。【本研究切入点】国内对于魔芋软腐病致病机理的研究报道较少，未见魔芋软腐病果胶酸盐裂解酶相关研究报道。【拟解决的关键问题】通过克隆技术得到魔芋软腐病中2个重要的果胶盐裂解酶基因pelD和pelE，并对2个基因进行生物信息学、原核表达和酶活性分析，以期获得正常表达的pelD和pelE基因。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株 研究采用的魔芋软腐病病原菌菌株由课题组分离自贵州省台江县。

1.1.2 试剂EscherichiacoliDH5α、pET28a(+)和EscherichiacoliBL21(DE3)均购自宝生物工程(大连)有限公司；RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒、T4DNA连接酶、2×TaqPCR MasterMix、TaqDNA Polymerase、6×buffer、10×buffer、SYBR RT-PCT Kit、蛋白酶K、DLMarker 2000、DLMarker 15000、PMD-18T和限制性内切酶均购于TaKaRa生物公司；cDNA第一链合成试剂盒、SM0431 maker购于Fermentas公司；质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购自Tiangen公司；卡那霉素、氨苄青霉素、潮霉素B(Sangon Biotech)购于sigma公司；琼脂糖购自Biowest公司；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.3 培养基 NA 培养基：酵母浸膏 1 g、牛肉浸膏 3 g、葡萄糖 10 g、蛋白胨 5 g、琼脂 18 g，加蒸馏水定容至1000 mL，调pH至7.0。NA 液体培养基：酵母浸膏1 g、葡萄糖 10 g、牛肉浸膏 3 g、蛋白胨5 g，加蒸馏水定容至 1000 mL，调节pH至7.0。LB 培养基：酵母粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g，加适量蒸馏水缓慢加热使其充分溶解，用蒸馏水定容至 1000 mL，加热混匀。

1.2 方法

1.2.1 基因组 DNA 的提取 提取参照DNA提取试剂盒说明书进行，-20 ℃保存备用。

1.2.2pelD和pelE基因引物设计 从GenBank中下载已注册的pelD和pelE基因同源序列，利用Primer 5 设计2个基因的扩增引物(表1)。

表1 pelD和pelE基因扩增引物Table 1 The amplified primers of pelD and pelE genes

1.2.3 PCR 扩增及产物克隆 以提取的DNA为模板，设计的引物进行PCR 扩增，参数：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，64 ℃(pelD)、60 ℃(pelE)退火1 min，72 ℃延伸10 min，30个循环；72 ℃再延伸10 min，12 ℃保存。电泳检测(1 %琼脂糖凝胶)，胶回收目的片段。将目的片段与 PMD-19T载体的连接，反应体系10 μl：PMD-19TVector DNA 1 μl，PCR 目的片段产物 4 μl，Solution I 5 μl，16 ℃连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞，37 ℃培养过夜，挑选单菌落，摇床培养扩繁，参考Tiangen公司的质粒小提试剂盒说明书提取质粒，双酶切验证，送出测序。

1.2.4pelD和pelE基因序列生物信息学分析 用DNAMAN (Virsion 6.0)软件和Protparam软件预测分析目的基因片段序列。跨膜结构预测在网页http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/上进行；亚细胞定位分析在网页http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/上进行；二级结构分析在网页http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html上进行，三级结构分析在网页SWISS-MODLE (http://swissmodel.expasy.org/interactive)上进行；利用Doolittle 算法对目的蛋白进行亲水/疏水性分析。

1.2.5 目的蛋白的原核表达分析 分别用相应的酶双酶切连有目的基因片段(pelD和pelE基因)的T-easy质粒和pET28a载体，胶回收目的基因和载体片段，将目的基因片段和载体片段按1∶1混合，加入T4连接酶，室温连接2～3 h，转化至大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中，37 ℃培养过夜，挑取单菌落进行摇菌培养、菌液PCR及酶切验证，将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌，37 ℃ 培养过夜，挑取单菌落，置于LB液体培养基中37 ℃过夜培养。取上清液接种于新鲜的LB 液体培养基中(菌液上清液：LB 液体培养基=1∶100)培养，在A600下测吸光值在0.6～0.8时，加入IPTG调节终浓度为1 mmol/L，于37 ℃诱导反应5 h，分别取1 mL菌液，经超声波破碎和离心后，将菌体沉淀用0.2 mmol/L PBS(Na2HPO4-Na2HPO4)重悬，室温摇床培养3 h， 4 ℃、12 000 r/min离心30 min，12 %的SDS-PAGE凝胶电泳检测上清液，用镍琼脂糖亲和层析法洗脱。

1.2.6 酶活性分析 超声波处理1.2.5中诱导5 h及未诱导的菌体(功率80 %，超声波振荡2 s，间歇4 s，总时间为10 min,制冷)，15 000 r/min离心5 min,取上清液用于测定酶活,酶活测定参照李洋等[11]的方法进行。

2 结果与分析

2.1 pelD 和 pelE 基因片段的扩增

从图1看出，对pelD基因和pelE基因进行常规 PCR 扩增，pelD基因在 1209 bp处有一特异条带，pelE基因在1080 bp 处有一特异条带，均与预测条带大小一致。

2.2 pelD 和 pelE 基因克隆至 PMD19-T 载体的鉴定

将pelD和pelE基因的目的片段经过凝胶回收，克隆至 PMD19-T 载体，转化E.coliDH5α感受态细胞。挑取阳性菌落进行 PCR 扩增(图2)和提取质粒双酶切(图3)，均得到与预期条带大小相当的条带。

2.3 pelD 和 pelE 基因序列测定

测序结果表明，pelD基因序列大小为1209 bp，pelE基因序列大小为1080 bp，与目的基因片段大小一致。Blast比对分析发现，这2个基因的序列与已报道的果胶酶基因pelD和pelE具有较高的同源性，且有完整的阅读框。

2.4 pelD 和 pelE 基因的生物学信息

通过Protparam预测分析发现(图4)，pelD基因编码一个完整的开放阅读框，阅读框架全长为1209 bp，编码氨基酸残基402个，具有起始密码子ATG和终止密码子TAA。基因编码的蛋白分子式为 C1891H2938N536O588S6，分子量为42.78 kDa，等电点为5.79，半衰期为30 h。不稳定系数为22.12，为稳定性蛋白。含39个负电荷氨基酸(Asp + Glu)，35个正电荷氨基酸(Arg + Lys)，没有赖氨酸拉链，果胶酸盐裂解酶折叠和致病因子的蛋白保守区在第94～301个氨基酸区域，在1～16 个氨基酸处存在信号肽；pelE基因含有一个完整的开放阅读框，阅读框架全长为1080 bp，编码氨基酸残基359个，含有起始密码子ATG 和终止密码子TAA。基因编码的蛋白分子式为C1891H2938N536O588S6，分子量为37.9 kDa，等电点为9.43，半衰期是30 h，不稳定系数为31.50，为稳定性蛋白。带负电荷氨基酸 (Asp + Glu)24个，正电荷氨基酸(Arg + Lys)41个，不含有赖氨酸拉链，果胶酸盐裂解酶折叠和致病因子的蛋白保守区为第94～301个氨基酸区域，在1～21个氨基酸处存在信号肽。

经跨膜结构分析发现，pelD蛋白无跨膜区，pelE蛋白在50～72个氨基酸处存在一跨膜结构域。经Protscale分析 pelD蛋白的亲水/疏水性发现，该蛋白含有165个疏水氨基酸，237个亲水氨基酸，亲水性氨基酸58.96 %，且在整个肽链中均匀分布，推测pelD蛋白为亲水性蛋白。pelE蛋白含有144个疏水氨基酸，215个亲水氨基酸，亲水性氨基酸59.89 %，且在整个肽链中均匀分布，推测pelE蛋白也为亲水性蛋白。对pelD蛋白质进行亚细胞定位分析得出，pelD蛋白定位于线粒体的可能性为4.4 %，作为信号肽的可能性为92.2 %。pelE蛋白作为信号肽的可能性为16.8.2 %,为其他成分的可能行为87.9 %。对pelD蛋白质二级结构预测发现，该蛋白含α螺旋24.88 %，β转角9.20 %，无规则卷曲39.05 %，延伸链26.87 %。pelE蛋白质含α螺旋17.55 %，β转角11.98 %，39.83 %无规则卷曲，延伸链30.64 %。并用 SWISS-MODLE预测得pelD 蛋白质的三级结构和pelE 蛋白质的三级结构(图5)，pelD蛋白三级结构折叠方式为单链右旋β螺旋，解析度为1.60A，扭曲值为-2.88，溶解值为-2.74，Cβ值为-1.51，Oligo-state为单体，GMQE值为0.64，QMEAN值为-3.68。pelE蛋白三级结构折叠方式为单链右旋β螺旋，解析度为2.10A,扭曲值为-2.91，溶解值为-1.56，Cβ值为-0.75。Oligo-state为单体，GMQE值为0.42，QMEAN值为-3.53。

2.5 目的蛋白的原核表达

对转化重组表达载体 pET28a-pelD和pET28a-pelE菌株转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达5 h后，SDS-PAGE 电泳分析看出(图6)，pelD 和 pelE蛋白均在在约45 ku处出现明显的条带。

2.6 目的蛋白的酶活性

从图7看出，诱导后pelD和pelE的酶活性均高于诱导前，pelD的酶活是诱导前的1.79倍，pelE是诱导前的1.75倍。表明，pelD及pelE基因均能正常表达，且经诱导后活性均显著上升，即研究获得了具有正常功能的魔芋pelD和pelE基因。

3 讨 论

果胶盐裂解酶是是植物细胞壁降解酶中重要的酶类，是植物病原菌的主要致病因子，其有关克隆和分析报道较多，1995年Heikinheimo等[12]研究Ecc SCC3193中的果胶酶发现，其编码的蛋白含有信号肽且与Ecc71菌株中的pel-3编码的蛋白相似，但与其他细菌分泌的pel蛋白差异较大。笔者等研究获得的pelD和pelE基因与李琦等[13]的研究结果相同,均含有信号肽。Hla等[14]研究表明，不同菌株中的同一种果胶酶同源性较低，可能是由细菌本身的特殊性导致。研究得到的pelD和pelE基因与其他果胶酶基因同源性较高，但这一结果是否证明这2个基因在进化上保守有待进一步研究。

果胶酶基因是软腐病侵染植物组织过程中的重要致病基因，作为果胶酶基因家族中的重要成员，pelD和pelE基因主要在降解植物组织细胞壁果胶物质中发挥作用。有研究表明，作为独立的转录单元，pelA、pelE和pelD基因对外界环境条件比较敏感，pelD和pelE基因的表达受pH 的影响较大，在碱性条件下，二者的活力均较低[15]；在酸性条件下，pelD基因主要表达于病菌侵染过程的早期，而pelE基因则在正常情况下转录[16]。在cAMP途径中,pelD和pelE基因的转录表达受CRP蛋白的抑制，但低浓度的Fe2+有利于pelD和pelE基因的表达。本研究对魔芋软腐病菌的pelD和pelE基因进行克隆分析和酶活性分析获得pelD和pelE基因的完整序列。经原核表达分析pelD和pelE的表达产物均在约45 ku 处有明显的条带,与Dickeya[17]的研究结果较吻合，IPTG诱导后pelD和pelE基因的酶活性分别是诱导前的1.79和1.75倍。表明，研究获得了具有正常功能的魔芋软腐病的pelD和pelE基因。为下一步研究魔芋软腐病菌果胶酶基因的功能提供了参考，为魔芋软腐病软腐病的防治提供了重要依据。

4 结 论

通过PCR克隆技术获得具有完整阅读框的魔芋软腐病pelD和pelE基因，2个基因均在约45 ku处出现明显的条带，pelD和pelE诱导后酶活分别是诱导前的1.79和1.75倍，2个基因具有正常功能。