一份水稻长穗突变体的鉴定及相关生理特性分析

文 欢，蒋 丹，南文斌,2，梁永书,2，张汉马,2，秦小健,2*

(1.重庆师范大学生命科学学院，重庆 401331；2.重庆市植物环境适应分子生物学重点实验室，重庆 401331)

【研究意义】水稻作为中国乃至世界上重要的粮食作物之一，类型丰富，具有悠久的栽培历史[1-2]。除作为粮食外，在医药和工业等方面也发挥着重要作用，其稳产与高产不仅对保证国家粮食安全具有重要意义，而且直接关系到全球社会的稳定与发展[3-5]。在对粮食的需求量越来越大和耕地面积不断减少的限制下，只能通过提高水稻单株产量来实现稳产与高产从而保证粮食安全[6-7]。穗型是影响水稻增产的重要因素之一，因此研究长穗水稻材料的生理指标，发掘优良的作物品种，从而为后续长穗突变材料的基因定位与克隆奠定了基础，同时也为水稻增产研究奠定基础。【前人研究进展】在耕地面积的限制下，想要保证水稻产量，除了杂种优势，最重要的就是通过株型来提高单株产量。株型在水稻的品质、产量、抗性和光能利用率上都有着重要作用，适当增加穗长、籽粒数量和提高结实率是实现水稻增产的主要途径[8-9]。穗部不仅与群体的结构状况和产量密切相关，是水稻高产育种和栽培的重点[10]，穗部在二氧化碳扩散、积累光合产物、改善群体光照状况以及抗逆性方面占据重要地位[11]。近年研究也发现穗型对水稻产量起着决定性作用，与穗粒数、抽穗期、穗长等诸多水稻的性状相关，而且直接决定稻穗分支的数量和长度，进而直接影响水穗的产量和品质[12-14]。其中穗长与穗数呈负相关，与株高、生长期呈显著正相关[15]。穗长影响籽粒的排列，与稻米品质、每穗颖花数和病虫害的发生都有很大的关系，因此开展水稻穗长的研究具有重要的理论意义和实践基础[16]。随着分子和遗传技术的发展，对穗长的研究不断深入。诱变筛选长穗突变体，发现该突变体的株高显著增高，穗长有不同程度的增长，在保留主要性状的基础上，有的性状发生了有利变化[17]。对不同群体对数量性状基因座(quantitative trait locus,QTL)的差异性以及不同环境下的水稻材料进行研究，越来越多与水稻穗长相关的QTL被定位和克隆[18-20]，已用于遗传育种过程[21]。同时建立水稻分子辅助育种技术体系，运用分子生物学技术寻找与粒长相关的基因[22]。目前，穗型是提高水稻产量的重要研究内容，但有关水稻穗长性状方面的研究仍然存在很多不足，相关基因还有待进一步挖掘和解析。【本研究切入点】本研究通过不同时期长穗材料与常规品种9311的生理指标进行测定和比较分析，进一步了解长穗材料的生理生化代谢特征。【拟解决的关键问题】此研究结果为后续穗长相关基因的进一步挖掘和研究奠定了基础，并通过解析水稻穗长发育调控的分子机制为后续的育种实践提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究实验材料为前期EMS诱变获得的水稻长穗突变材料和常规水稻品种9311。所有试验均在重庆师范大学根系发育与氮高效利用实验室进行。

1.2 相关生理生化指标测定

1.2.1 材料的获取 长穗材料与对照材料9311于2019年4月初在重庆师范大学根系发育与氮高效利用重点实验室试验田进行播种并于5月初进行大田移栽。在苗期对长穗材料与常规水稻品种9311进行3次重复取样,然后进行相关生理指标测定和分析。待其抽穗结实后以同样方式取样,并分析检测其根、茎、叶的各项生理指标。

1.2.2 农艺性状统计与分析 选取成熟后的长穗材料和9311的各3株且重复3次，分别统计其一次枝梗数、二次枝梗数、千粒重、每穗粒数、结实率等性状。数据利用Excel和Graphpad prism5进行相关分析。

1.2.3 SOD活性测定 用氮蓝四唑(NBT)还原法测定SOD含量。将样品在液氮中磨成浆后加入磷酸缓冲液，离心后加入NBT、甲硫氨酸溶液等进行显色反应10～30 min，NBT被还原为蓝色的甲腙，该物质在560 nm处有最大吸收。

1.2.4 叶绿素含量测定 用乙醇浸提法测定叶绿素含量，将茎叶剪碎后放于离心管中加入抽提液，4 ℃避光抽提12 h，再用酶标仪分别测定波长640 和663 nm下的吸光值。

1.2.5 脯氨酸含量测定 用酸性茚三酮法测定脯氨酸含量，称取0.3 g样品加入5 mL 3 % 磺基水杨酸溶液沸水煮10 min，吸取2 mL提取液加入2 mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮沸水煮30 min,冷却加入甲苯静置后在波长为520 nm处比色，其色度与脯氨酸含量成正相关。

1.2.6 可溶性糖含量测定 用蒽酮比色法测定可溶糖含量，称取0.3 g样品剪碎后在沸水中煮10 min,冷却后取2 mL加入蒽酮试剂，摇匀后沸水煮10 min，冷却后在波长为620 nm处测其吸光度，色度与可溶性糖的含量成正比。

1.2.7 可溶性蛋白含量测定 用考马斯亮蓝G250法测定可溶蛋白含量，称取0.3 g样品，加水研磨后离心，取1 mL溶液加入5 mL考马斯亮蓝G250，该物质与可溶性蛋白结合后变为青色，在595 nm下有最大吸收值。

1.2.8 丙二醛含量测定 用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid，TBA)法测定丙二醛含量，将样品剪碎后加入5 mL 10 % 三氯乙酸研磨至匀浆，加入0.5 %TBA后沸水煮10 min，冷却后用酶标仪测定波长在450、532、600 nm处的吸光值。

1.3 数据处理

所有实验数据处理利用 Excel进行，相关性分析和作图采用GraphPad Prism5和CorelDRAW X4来完成。

2 结果与分析

2.1 长穗材料相关农艺性状统计分析

对长穗材料的相关农艺性状进行统计分析，与常规水稻品种9311相比，发现其穗长、每穗粒数、二次枝梗数均有增加且达到差异显著水平，而长穗材料的千粒重与9311相比显著性降低。另外，长穗材料的结实率降低而单株产量方面有所增加但均为差异不显著(图1)。该材料作为一份优异的水稻长穗种质资源,为后续水稻穗长相关基因定位克隆提供了材料基础,同时为培育高产优质的杂交水稻新品种提供了可能。

2.2 叶绿素含量分析

叶绿素作为光合作用反应过程的关键色素分子，其含量与植物光合作用效率及氮素营养密切相关，为植物的生长发育提供有机物。通常在一定条件下植物的产量与叶绿素含量呈正比,通过植物叶绿素含量测定对了解植物生长发育以及水稻育种十分重要。通过测定长穗材料与9311幼苗期和成熟期两个时期的叶绿素含量，发现长穗材料幼苗期茎和成熟茎、叶中的含量显著高于9311，而9311幼苗期叶中的含量显著高于长穗材料，其中成熟期茎中的含量存在极显著差异(图2)。该结果表明随着生长发育的进行,尤其在生长发育后期长穗材料可能具有更高的光合效率。

2.3 SOD和丙二醛含量测定

SOD作为一种抗氧化酶，在机体氧化与抗氧化平衡中起着重要的作用，而丙二醛含量可反应植物的抗逆性。分别测定长穗材料与9311幼苗期和成熟期的SOD和丙二醛(MDA)含量，分析发现MDA含量，9311幼苗期根和成熟期茎中的含量高于长穗材料，成熟期长穗材料叶中的含量明显高于9311，其它无明显差异，而在SOD活性方面，长穗材料幼苗期根和茎中的含量显著高于9311，成熟期9311叶中的含量显著高于长穗材料，其它无明显差异(图3)。从SOD和丙二醛测定的结果表明，与常规品种9311相比，长穗材料在幼苗期的抗逆性可能高于9311，而随着生长发育进行到成熟期时其抗逆性可能相比较弱。

2.4 脯氨酸含量分析

脯氨酸作为植物蛋白的组成成分之一，其含量在一定程度上反应了植物的抗逆性。为了进一步分析与验证长穗材料的抗逆特性，分别测定长穗材料和9311的幼苗期和成熟期两个时期的脯氨酸含量，发现幼苗期的根和茎中脯氨酸含量存在显著差异，均为长穗材料高于9311，而到成熟期时在根和叶中存在显著差异，均为9311高于长穗材料(图4)。结果表明，在不考虑其他因素的情况下，幼苗期的长穗材料抗逆性更强，到成熟期时其抗逆性与相比9311变弱，该结果与丙二醛和SOD的分析结果一致。

2.5 可溶糖与可溶蛋白含量测定

可溶糖是植物生长发育和基因表达调控过程的重要调节因子，在植物的整个生长周期中具有重要作用。为了解长穗材料不同发育阶段的可溶性糖含量，分别在幼苗期和成熟期测定长穗材料与9311中的可溶性糖，结果显示长穗材料的幼苗期叶和成熟期根、叶中的可溶糖含量均显著高于9311，而9311成熟期茎中的含量高于长穗材料，其它无明显区别(图5-A和5-B)。另外，同时对2份材料的可溶性蛋白进行了测定，发现长穗材料幼苗期的根、茎、叶中均显著低于9311，而成熟期的根中几乎没有检测到可溶性蛋白，长穗材料的茎部含量明显高于9311且叶部没有明显区别(图5-C和5-D)。

2.6 长穗材料各生理生化指标的相关性

为进一步了解长穗材料在幼苗期和成熟期阶段各生理生化指标的相互关系，对该材料在两个阶段不同生理指标进行相关性分析发现，仅在长穗材料的幼苗期，茎部的脯氨酸含量和可溶糖含量呈极显著的负相关，叶部的SOD含量与脯氨酸含量也存在极显著的负相关性，其余指标存在的相关性均未达到显著水平(表1)。另外，成熟期各相关指标间存在一定的相关性，但均未达到显著水平(表2)。对不同部位在不同阶段的各相关指标进行关联分析，深入了解长穗材料在各生长发育阶段的生理响应差异十分重要，同时也为后续进一步的研究工作提供一定帮助。

表1 长穗材料幼苗期生理指标相关性分析Table 1 Correlation analysis of physiological indexes in seedlings stage of long panicle rice

表2 长穗材料成熟期生理指标的相关性分析Table 2 Correlation analysis of physiological indexes in mature stage of long panicle rice

3 讨 论

3.1 水稻穗型与产量的关系

水稻作为重要的粮食作物之一，如何提高或者保障水稻的产量成为当前水稻研究的重要内容之一[23]。在对粮食需求量不断增加情况下，提高和保证水稻产量是目前育种的首要任务和目标。因此，创制和挖掘优异的水稻种质资源，同时克隆和解析水稻产量关键基因对于保证国家粮食安全有十分重要的意义。已有研究表明，水稻穗长是一种受多基因控制数量性状，易受环境的影响，同时对水稻产量产生直接影响[24]。贾宝艳等[25]认为水稻的质量和产量与穗部性状是显著的线性关系，研究穗部性状，有利于找寻理想株型，提高水稻产量和质量[26]。胡继鑫[27]研究辽宁地区不同水稻穗部性状发现，适当增加穗长来提高产量。胡继新[28]对水稻穗部研究表明，穗部性状是产量结构重要组成部分，在不同的品种中差异较大。本研究中，针对长穗材料进行了相关农艺性状分析，发现长穗材料与常规品种9311相比，穗长差异显著，每穗粒数和二次枝梗数明显较多，产量有所提高，说明穗部性状与产量密切相关。

3.2 生理生化指标的测定与差异

根据之前研究表明丙二醛、SOD、脯氨酸、可溶糖和可溶蛋白与植物的抗逆性相关。戴高兴等[29]以早稻品种瑰宝8号以及耐低钾变异后代为材料模拟干旱胁迫，发现丙二醛、脯氨酸和SOD含量发生变化，表现为丙二醛、脯氨酸迅速上升，SOD先急剧上升后迅速下降。黄显波等[30]在38 ℃高温下以谷优1292杂交籼稻为试验材料，结果表明，随着胁迫时间延长，丙二醛、脯氨酸含量逐渐上升，SOD活性逐渐减低。Saladin等[32]认为可溶性糖作为植物渗透调节的物质，其含量增加，有利于植物在干旱环境中生长。本研究中对获得的长穗材料进行相关生理生化指标测定，长穗材料和9311相比，幼苗期的SOD、可溶糖、茎中的叶绿素和脯氨酸含量较高，成熟期的叶中的丙二醛、根中的可溶糖和叶绿素含量较高。表明在不同的发育时期植物体内各种物质的含量存在差异，其生理响应不同。与常规品种9311相比，长穗材料在幼苗期的抗逆性较好，但可能随着生长发育的进行其抗逆性变弱。

3.3 各生理指标间的关系及长穗材料的后续研究

李佐同等[31]以抗病品种龙选9070、普粘7和感病品种丽江新团黑谷为材料，明确了可溶糖和可溶蛋白含量高有利于增强水稻对稻瘟病的抗性，说明可溶糖和可溶蛋白与水稻的抗病性相关。陈晓远等[33]测定水分胁迫下水稻品种金优402的可溶糖和游离脯氨酸的含量，发现随时间延长，两者的含量均上升。雷东阳等[34]用其杂交水稻及其恢复系为材料，研究水稻抽穗扬花期在高温下对生理指标的影响，结果发现丙二醛和可溶糖含量均升高。何开跃等[35]通过测定不同低温和冷冻处理的福建柏苗的可溶糖和丙二醛，结果两者含量均上升。王娟等用玉米根系为材料模拟水分胁迫，发现SOD和MDA的含量呈极显著负相关。本研究中笔者对丙二醛、SOD和脯氨酸等6项生理指标进行了相关性分析，对于长穗材料而言，幼苗期茎部的脯氨酸含量和可溶糖含量呈极显著负相关，叶部的SOD含量和脯氨酸含量也存在极显著的负相关性，表明在应对环境变化过程中，有多种物质相互作用共同参与调节生长发育与机体平衡。目前，正在构建长穗材料和9311的遗传群体，为后续定位和克隆穗长相关基因奠定材料基础，希望能进一步在分子水平揭示候选基因的调控功能，为水稻的分子育种奠定基础，同时也为水稻高产品种的选育提供一定的支撑。

4 结 论

长穗材料穗长与常规品种9311相比差异显著，具有每穗粒数、二次枝梗数多的优点，在一定程度上提高了水稻产量。其次，长穗材料幼苗期的SOD酶活性、脯氨酸和可溶糖含量显著高于9311，说明长穗材料在幼苗期时的抗逆性较好；但是长穗材料在成熟期阶段的SOD酶活性和脯氨酸含量显著低于9311，说明在生长发育后期其抗逆性不如9311，可能更易受环境因素的影响。另外，各指标间相关性分析表明，幼苗期茎部的脯氨酸含量和可溶糖含量呈显著负相关，同时叶部的SOD含量和脯氨酸含量也存在极显著的负相关性。