怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白基因的克隆和序列分析

洪森荣,曾晓健,魏 杰,温倩文,谢 微,杨玉琪,姚 梦,易奥情,于小姣,蔡 红,陈荣华

(1.上饶师范学院生命科学学院,江西 上饶 334001；2.上饶市药食同源植物资源保护与利用重点实验室，江西 上饶 334001；3.上饶市薯芋类作物种质保存与利用重点实验室，江西 上饶 334001；4.上饶农业技术创新研究院，江西 上饶 334001；5.上饶市红日农业开发有限公司,江西 上饶 334700)

【研究意义】怀玉山高山马铃薯，俗名麻籽洋芋，营养全面，还原糖未检出，非常适合三高人群辅助治疗[1]。怀玉山高山马铃薯种植于海拔 500 m 以上高山环境，病害虫较少，有利于生产无公害怀玉山高山马铃薯。2015年，中国启动马铃薯主粮化战略，在此背景下，发展怀玉山高山马铃薯产业是保障粮食安全、促进农民增收又一选择[2]。【前人研究进展】马铃薯病毒病可引起种质退化、产量下降、品质变劣、商品性差，严重影响薯农的经济效益[3]。烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus， TMV)是黑龙江马铃薯产区极易侵染的病毒，但江西马铃薯产区未检出TMV[4]。研究表明，辣椒L基因控制TMV 抗性，引起细胞过敏性死亡[5]。另外，从杏毛头鬼伞[6]、鲍菇[7]和榆黄蘑[8]中也筛选出抗烟草花叶病毒y3基因、xb68Ab蛋白和YP46-46蛋白，抗TMV活性较强，且烟草中抗TMV的N基因和 TMV 之间的互作以及N基因介导的抗病反应和信号传导也已探明[9-10]。【本研究切入点】尹明华等[11]对怀玉山高山马铃薯进行了转录组分析，发现怀玉山高山马铃薯表达了抗TMV蛋白基因，这可能是TMV无法侵染怀玉山高山马铃薯的主要原因。【拟解决的关键问题】目前，关于马铃薯抗马铃薯Y病毒(PVY)基因已经克隆[12]，而关于马铃薯抗TMV蛋白基因的研究少见报道。本研究通过从构建的怀玉山马铃薯转录组数据库中挑选抗TMV蛋白基因序列对其进行克隆，并对其进行生物信息学分析，为分析怀玉山马铃薯抗TMV蛋白基因保守结构域提供基础资料，对进一步揭示怀玉山马铃薯抗TMV蛋白的生物学功能提供理论依据，也为深入分析其它植物的抗TMV蛋白结构与功能关系提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

怀玉山高山马铃薯试管苗由上饶师范学院生命科学学院植物组织培养室提供。

1.2 总 RNA 的提取和 cDNA 第一链的合成

用Trizol 试剂提取怀玉山高山马铃薯试管苗的总 RNA，提取步骤按说明书进行，使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的浓度和完整性。以提取获得的 RNA为模版，按照 M-MLV cDNA 第一链合成试剂盒说明书合成 cDNA 第一链。逆转录引物用 Oligo(dT) 18 Primer ：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，具体步骤按说明书进行。

1.3 怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白基因基因的克隆

利用怀玉山高山马铃薯试管苗转录组数据库筛选出抗TMV蛋白基因的核心片段，运用 Primer Premier 5.0 设计基因特异性引物(F:ATGGCATCATCTTCTTCTTCTTTTG；R:CTATAATCCCGAGCTTGTGGG)。PCR扩增条件：95 ℃ 2 min；【95 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s】(35个循环)；72 ℃ 10 min。PCR 产物经 1 %琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有目的基因的条带与 pMD19-T 载体连接并用热激法转化到感受态细胞E.coliDH5α， 经鉴定正确的阳性转化子提取质粒送往上海生工进行测序。

1.4 生物信息学分析

按照彭波等[13]的方法对怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白进行氨基酸序列分析、理化性质分析、结构预测、功能分析。

2 结果与分析

2.1 怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白一级结构分析

2.1.1 怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白基因cDNA序列 怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白基因cDNA总长度为4335 bp(图1)，G+C 含量为38.22 %(图2)。

2.1.2 怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白氨基酸序列 Protparam预测显示，怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白由1444个氨基酸组成(图3)，分子量165 229.13 Da，等电点5.78，为亲水性蛋白。各氨基酸的数目和比例为Ala (A,54，3.7 %)、Arg (R,62，4.3 %)、Asn (N,77，5.3 %)、Asp (D,88，6.1 %)、Cys (C,39，2.7 %)、Gln (Q,52，3.6 %)、Glu (E,112，7.8 %)、Gly (G,70，4.8 %)、His (H,40，2.8 %)、Ile (I,79，5.5 %)、Leu (L,211，14.6 %)、Lys (K,107，7.4 %)、Met (M,26，1.8 %)、Phe (F,64，4.4 %)、Pro (P,51，3.5 %)、Ser (S,145，10.0 %)、Thr (T,39，2.7 %)、Trp (W,18，1.2 %)、Tyr (Y,47，3.3 %)、Val (V,63，4.4 %)、Pyl (O,0，0.0 %)、Sec (U,0，0.0 %)。带负电残基总数(Asp+Glu)为200，正电荷残基总数(Arg+Lys)为169。原子组成：碳(C) 7381，氢(H) 11612，氮(N)1964，氧(O) 2205，硫(S) 65；分子式：C7381H11612N1964O2205S65，原子总数：23 227。摩尔消光系数以M-1cm-1为单位，在水中测量的280 nm处，Abs 0.1 %(=1 g/L)1.037，假设所有对半胱氨酸残基形成胱氨酸，外系数171405；Abs 0.1 %(=1 g/L)1.023，假设所有Cys残基均减少，外部系数169030。所考虑序列的N端是M(Met)，估计半衰期为30 h(哺乳动物网织红细胞，体外)，>20 h(酵母，体内)，>10 h(大肠杆菌，体内)。不稳定指数：失稳指数(II)计算为42.64，这将蛋白质归类为不稳定的。脂肪指数：94.72，总平均亲水性为-0.319。

2.1.3 怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白亲疏水性分析 从图4可知，高峰值(正值)的区域表示疏水的区域，而负值的“低谷”区域是亲水区域。疏水性结果分析表明，最大疏水值为2.5左右，说明该多肽该处的疏水性最强;亲水峰最大值为-3左右，整个蛋白质表现出高度的亲水性，说明该蛋白为亲水性蛋白质。

2.2 怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白二级结构和三级结构分析

怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白的二级结构(图5)预测如下：GOR 预测显示其二级结构由α-螺旋(Alphahelix，Hh，43.77 %)、β-片层(Extendedstrand，Ee，12.47 %)、无规则卷曲(Randomcoil，Cc，43.77 %) 构成(图6)。从分布位点上来看，C端含无规则卷曲和β-片层，N端含β-片层和α-螺旋，且无规则卷曲、β-片层和α-螺旋则散布于整个蛋白质中。由于该蛋白质未搜索到同源蛋白，无法进行三级结构模拟。

2.3 怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白亚细胞定位

采用 Psort在线软件对怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白基因的表达部位进行预测(图7)， 定位于细胞核中的数量为8，叶绿体中的数量为2，线粒体中的数量为2，细胞骨架中的数量为2，表明怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白主要存在细胞核中。

2.4 怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白系统进化分析

从构建的进化树(图8)中可见，怀玉山高山马铃薯与S.tuberosum(马铃薯)TMV resistance protein N-like isoform X1(类TMV抗性蛋白N亚型X1)、S.tuberosum(马铃薯)TMV resistance protein N-like isoform X2(类TMV抗性蛋白N亚型X2)、S.tuberosum(马铃薯)N-like putative resistance gene 2(类N假定抗性基因2)、S.tuberosum(马铃薯)TMV resistance protein N-like(类TMV抗性蛋白N)、S.lycopersicum(番茄)uncharacterized protein LOC101265700(非特征蛋白质 LOC101265700)、S.pennellii(野生种潘那利番茄)uncharacterized protein LOC107004430 isoform X1(非特征蛋白质 LOC107004430亚型X1)和S.pennellii(野生种潘那利番茄)uncharacterized protein LOC107004430 isoform X2(非特征蛋白质 LOC107004430亚型X2)在一个大分支下，这说明怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白在进化上与马铃薯、番茄和野生种潘那利番茄的亲缘关系较近，尤其是与S.tuberosum(马铃薯)TMV resistance protein N-like isoform X1(类TMV抗性蛋白N亚型X1)和S.tuberosum(马铃薯)TMV resistance protein N-like isoform X2(类TMV抗性蛋白N亚型X2)在进化上具有最高的亲缘关系。

3 讨 论

烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的代表种，主要危害烟草、番茄和马铃薯等作物[14]。研究表明，TMV侵染存在地理隔离[15]。通过生化手段，绞股蓝抗TMV蛋白(gynostemmin)被分离，分子量20～30 kD，等电点>8.0，N端含19个氨基酸残基(DINFSLAGADGQTYNTFIA)，是一种新的I型核糖体失活蛋白[16]。辣椒L基因决定了辣椒对TMV的抗性，L基因属于 CC-NBS-LRR(nucleotide-binding site-leucine-rich repeat)型R基因，具有NBS-LRR保守氨基酸序列[17]。烟草抗TMV基因N能编码1个131.4 kDa的蛋白质，无跨膜区域和信号序列，主要存在于细胞质，其氨基末端结构域与果蝇Toll蛋白和哺乳动物白细胞介素-1受体(IL-1R)的胞质结构域相似，是核苷酸结合位点(NBS)和4个不完全富含亮氨酸重复序列(LRR)，N、Toll和IL-1R序列的相似性表明，N通过Toll-IL-1样途径介导快速基因诱导和TMV抗性[18-19]。TMV侵染烟草后，克隆到1个抗性基因CN，与抗烟草花叶病毒基因N同源，编码区(3423 bp)与抗TMV基因N的核苷酸同源性分别为93.63 %，CN属于TIR/NBS/LRR基因类[20]。烟草中还克隆到1个NH基因，编码区为5.028碱基对(bp)与N基因同源性为82.6 %，属于TIR/NSB/LRR基因类[21]。在本试验中，怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白由1444个氨基酸组成，分子量165 229.13 Da，等电点5.78，在进化上与马铃薯、番茄和野生种潘那利番茄的亲缘关系较近，尤其是与Solanumtuberosum(马铃薯)TMV resistance protein N-like isoform X1(类TMV抗性蛋白N亚型X1)和Solanumtuberosum(马铃薯)TMV resistance protein N-like isoform X2(类TMV抗性蛋白N亚型X2)在进化上具有最高的亲缘关系。说明，怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白基因与绞股蓝抗TMV蛋白不同，但与烟草抗TMV蛋白基因 N同源性较高。本研究克隆的怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白是怀玉山高山马铃薯首次报道的蛋白类活性物质。它的克隆有助于加强怀玉山高山马铃薯研究和开发的力度。

4 结 论

怀玉山高山马铃薯抗TMV蛋白具有典型抗TMV蛋白的结构特征，氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高，在进化上高度保守，对进一步揭示该蛋白生物学功能具有重要意义。