激活自噬对关节腔内注射糖皮质激素大鼠骨关节炎进展的影响

薛恩兴，胡飞，李浩量，邱思桐，周腾，吴登颖

1.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 关节与骨病外科，浙江 温州 325027；2.温州医科大学 第二临床医学院，浙江 温州 325035

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见的以进行性关节软骨退行性变、功能障碍为主的疾病[1]。糖皮质激素关节腔内注射是临床广泛使用的治疗OA的方法[2]。虽然长期反复使用糖皮质激素会带来诸多不良反应，但针对某些特定病程阶段的人群（如局部应用非甾体类抗炎药无效但尚不需要手术干预的人群），糖皮质激素的使用是可以进行权衡的。因此改进糖皮质激素在OA治疗中的应用方 式、研究其作用机制，成为热点和难点。自噬对细胞生长、分化、发育和体内平衡起重要作用[3]。研究表明，自噬与关节软骨的退变密切相关，腹腔或者关节腔注射雷帕霉素会提高自噬水平，可以明显缓解大鼠关节软骨退变的程度[4-5]。本研究围绕糖皮质激素关节内注射和改变机体自噬水平，观察激活自噬对关节腔内注射糖皮质激素大鼠OA进展的影响，以初步探索减少临床上使用糖皮质激素相应不良反应的方法和策略。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：健康雄性SD大鼠50只，体质量约270 g，由温州医科大学实验动物中心提供，饲养于适宜的环境中（温度为20～28 ℃，湿度为45%～70%，24 h昼夜循环光照，自由摄食饮水）。本实验中动物的伦理事项遵循NIH实验动物指南，实验动物许可证号：SCXK（浙）-2015-0009。

1.1.2 试剂和仪器：地塞米松、safranin-O（美国Sigma公司）；雷帕霉素（上海源叶生物科技有限公司）；兔抗来源的P62抗体原液（美国Abcam公司）；倒置相差显微镜（日本Nikon公司）；Olympus BX-40光学多倍倒置显微镜（日本Olympus公司）；Leica-CM1900组织切片机（德国Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模：将大鼠随机分为假手术（Sham）组、造模（OA）组、糖皮质激素（OA+GS）组、雷帕霉素（OA+RAPA）组、糖皮质激素+雷帕霉素（OA+GS+ RAPA）组，每组10只。

采用以Hulth造模法为基础的大鼠OA造模方法[6]。Sham组沿手术入路划皮后直接将切口进行缝合。其余各组大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后仰卧位固定。在无菌条件下，取内侧纵行切口，暴露膝关节，离断前后交叉韧带及内侧副韧带，切除内侧半月板，手术中尽量避免损伤关节软骨面，8周后观察大鼠关节炎造模成功情况。OA+GS组和OA+GS+RAPA组大鼠第6周开始在膝关节内注射糖皮质激素，每周1次，连续4次。糖皮质激素剂量= 6.25（人与大鼠用药等效剂量换算出的固定系数）× 0.42 mg/kg，每只大鼠每次注射0.709 mg（0.028 mL） 即为相应人体的常规剂量。OA+RAPA组和OA+GS+ RAPA组从手术当天开始腹腔注射自噬激活剂雷帕霉素，每天1 mg/kg，持续10周。Sham组与OA组予以同剂量的DMSO腹腔注射。术后第10周，处死所有实验大鼠，取其右膝关节组织，固定、脱钙后制作成组织蜡块，进行下一步的实验分析。

1.2.2 组织学safranin-O固绿（S-O）染色：大鼠组织切片脱蜡、水化，置入苏木精染色液中7 min，蒸馏水漂洗2次后，浸泡入分色液中3～5 s，再次漂洗5次，然后将组织切片置入0.05%的Fastgreen染色液中1～5 min，蒸馏水漂洗3次，置于1%醋酸溶液中分色处理，结束后再次进行漂洗。切片脱水、透明、封片，镜下观察。

1.2.3 组织评分：对S-O染色后的组织切片进行评分。通过OARSI评分系统[7]评估大鼠关节软骨的退变程度。0分：表面完整，软骨完好无损；1分：表面完整；2分：表面不连续；3分：垂直裂缝；4分：侵蚀；5分：剥蚀；6分：变形。将内侧股骨和胫骨平台分数相加（0～12分）以评估关节软骨退变的程度。采用滑膜评分来评估大鼠关节滑膜的改变[7]。0分：光滑正常，半透明的滑膜组织，血管稀疏清晰；1分：局灶性受累，轻微变色，可见增生/纤维化/增厚，血管明显增加；2分：弥散性受累，轻微变色，可见增生/纤维化/增厚，血管显著扩张；3分：中度弥漫性浸润，严重变色，明显增生/纤维化/增厚，中度血管增生；4分：显著漫性浸润，严重变色，显著的增生/纤维化/增厚，弥漫性血管过度增生；5分：严重弥漫性浸润，严重变色，严重的增生/纤维化/增厚，组织纤维化和严重的血管过度增生。

1.2.4 免疫组化染色：大鼠组织切片脱蜡、抗原修复、血清封闭后，加一抗于4 ℃冰箱中保存过夜。PBS漂洗，擦干组织周围的PBS后加上二抗，然后将组织置于37 ℃恒温箱中孵育30 min。显色、复染苏木精后，切片脱水、封片，拍摄图像后使用Image J 2.1软件对阳性点进行定量。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS19.0软件进行统计学分析。计量资料以 ±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠软骨改变 由图1可见，OA组的关节软骨部分区域出现缺损，OA+GS组缺损依旧比较严重，OA+RAPA组的软骨表面侵蚀有所好转，而OA+ GS+RAPA组大鼠糖皮质激素联合使用雷帕霉素后，?关节软骨侵蚀的现象则进一步好转。

2.2 各组大鼠膝关节组织评分比较 OA组大鼠OARSI评分较Sham组显著升高（P＜0.05），证明造模成功；OA+GS组大鼠OARSI评分与OA组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；OA+RAPA组大鼠评分与OA组比较有所降低（P＜0.05），OA+GS+RAPA组大鼠评分与OA+GS组比明显较低（P＜0.05）。见图2。

OA组滑膜出现肥大增生症状，OA+GS组滑膜评分与OA组比较明显降低（P＜0.05），而OA+GS+RAPA组的滑膜评分与OA+GS组比较差异有统计学意义 （P＜0.05）。见图3。

2.3 各组大鼠免疫组化染色结果 如图4所示，OA组关节表面存在大量P62阳性表达，OA+GS组、OA+RAPA组阳性点较OA组减少；定量分析比较得出，OA+GS+RAPA组阳性比例较OA+GS组、OA+RAPA组进一步减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

OA是目前老年人疼痛和残疾的主要原因之一，肥胖、衰老、关节损伤和生物力学异常被认为是OA的主要危险因素[8]。临床上对于OA阶梯治疗的非手术阶段通常是以控制疼痛、抗炎、消除关节肿胀等姑息方法来延缓其进展。

非甾体类抗炎药是有效的止痛药，但不能治疗或预防潜在的疾病，且会对使用者胃肠道与心血管造成危害，临床上通常以短期或中短期，根据需要间歇使用[9]。目前，对于口服或局部镇痛药尚不能缓解症状的患者，指南建议联合关节腔内注射皮质类固醇激素治疗[10]。糖皮质激素可减轻免疫反应，降低毛细血管通透性，减轻充血，促进细胞间质水肿消退，从而起到抗炎、镇痛、消肿的作用[11-12]， 但是长期使用会带来骨质疏松、代谢紊乱、皮肤萎缩等不良反应。糖皮质激素对各种类型的细胞存在毒性作用，使用糖皮质激素会导致软骨细胞减少和凋亡[13-14]。本研究在动物模型上模拟关节内注射糖皮质激素，相比OA组，注射糖皮质激素后大鼠的滑膜评分有所降低，关节内注射糖皮质激素可以在一定程度上抑制OA进展中关节滑膜的炎性增生，但是，OARSI评分结果显示，糖皮质激素干预下，软骨侵蚀现象并未有明显的改善。

自噬是一种程序性死亡方式，已有研究证实降低软骨细胞P62水平，增强LC-3 II/LC-3 I的表达，能够抑制细胞基质降解[15]。而体内实验通过敲除自噬特异性基因Atg5和Atg7抑制自噬水平后，软骨细胞的死亡增加，增殖减少，进一步证实自噬对软骨细胞生存和维持正常生理功能起重要的作用[16]。 研究报道，自噬可以抑制IL-1β引起的软骨细胞中aggrecan、II型胶原等基因的下降，并可以维持细胞外基质的平衡[4]。OA的病理表现不仅包括物理上的磨损过程，还涉及到软骨侵蚀、破坏增多，软骨细胞外基质紊乱，滑膜组织增生等一系列复杂的过程，其中，软骨表面破坏是最明显的改变。P62是众所周知的自噬相关蛋白，也称为SQSTM1蛋白，可在细胞中发挥调节自噬的作用。本研究显示，OA组关节软骨破坏增多，滑膜增生，软骨中P62表达增多，而通过上调大鼠的自噬水平，能对关节软骨起到保护功能。OA+GS+RAPA组中，关节软骨侵蚀与破坏得到了明显的缓解，免疫组化结果表明，关节软骨中P62的表达下降，这说明上调自噬对关节软骨的退变有一定的积极干预作用。

图4 大鼠关节软骨P62免疫组化结果及阳性细胞比例（×10）

综上所述，激活自噬对糖皮质激素关节腔内注射的OA大鼠的关节软骨具有显著保护作用，而干预自噬可能是减轻糖皮质激素治疗OA产生不良反应的新方向。