山西省部分地区猪圆环病毒2 型基因遗传变异分析

高 宇，孟玉凯，王 晨，石玉节，张 甜，岳伟东，朱东阳，马海利

（山西农业大学动物医学学院，山西太谷030801）

自1991 年加拿大报道首例PCV2 引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）以来，猪圆环病毒病已成为影响世界养猪业的重要传染病之一，给养猪业造成了巨大的经济损失[1-4]。猪圆环病毒（PCV）属于圆环病毒科圆环病毒属，是至今发现的最小动物病毒。根据基因序列的不同，PCV 分为PCV1、PCV2、PCV3 和PCV4[5-6]。其中，PCV2 可损伤猪的免疫系统，被认为是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）等多种病症的病原体，给养殖业带来巨大的损失[7]。

目前，对于PCV2 的预防措施主要是免疫接种，市场上主要有PCV 2a，PCV 2b 和PCV 2d 等3 种疫苗基因型，但是PCV2 基因型较多，国内外均有免疫失败的案例报道，因此，对于山西地区的PCV2 遗传变异分析很有必要。PCV2 基因为单股环状DNA分子，全长1767bp 左右，有13 个开放阅读框（ORF）。目前对ORF1、ORF2 与ORF3 的功能研究较为清楚，其他开放阅读框的功能尚不明确[8]。ORF1 基因高度保守，编码与病毒复制相关的Rep 蛋白和Rep'蛋白[9-10]；ORF 2 基因变异程度较高，位于基因组反义链上，基因长为702 bp 或705 bp，编码PCV2 唯一的结构蛋白Cap 蛋白，Cap 蛋白与免疫和病毒的感染密切相关，可以诱导机体产生针对PCV2 的特异性中和抗体[11-12]；ORF3 基因长为315 bp，位于ORF1内，按相反方向进行转录，编码104 个氨基酸的凋亡蛋白，在诱导感染细胞凋亡方面有着重要作用[13-14]。

为了解山西省PCV2 的流行情况及PCV2 病毒株的遗传差异情况，2019 年收集山西省部分地区PCV2 疑似感染病料用PCV2 基因鉴定引物进行PCR 扩增和凝胶电泳，对于鉴定阳性样品进行全基因扩增及测序，并将拼接好的PCV2 序列与GenBank 中公布的PCV2 基因序列进行比对分析，构建基因进化树，为山西省猪圆环病毒病2 型防控疫苗的基因型选择及疫苗研发提供一定的参考依据。

1 材料和方法

1.1 样品来源

疑似PCV2 感染肺脏组织收集自山西省阳泉、柳林、平遥、泽州和高平5 个地方的屠宰厂，每个地方收集3 份，共15 份。

1.2 主要试剂

DNA 提取试剂盒购买自天根生化科技（北京）有限公司；DL 2000 DNA Marker、2×TaqMaster-Mix购买自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 引物

PCV2 特异鉴定引物和PCV2 全基因扩增引物分别源自参考文献[15]和[16]（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 病毒基因组DNA 的提取

取猪肺脏组织2 g 左右于研钵中，加液氮研磨粉碎后移至2 mL EP 管中，加入500 μL PBS 溶液，按照DNA 提取试剂盒说明书提取病毒基因组DNA，置-20 ℃冰箱保存，备用。

1.5 疑似PCV2 鉴定

以提取的病毒基因组DNA 为模板，用PCV2鉴定引物进行PCR 扩增，反应体系为20 μL，反应参数为：预变性94 ℃4 min；94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，共30 个循环；72 ℃终末延伸7 min，4 ℃暂时保存。核酸凝胶电泳检测扩增产物片段大小是否与预期一致。

1.6 PCV2 全基因扩增与测序

以鉴定PCV2 阳性样品的基因组DNA 为模板，用PCV2 全基因扩增的4 对引物分别进行PCR扩增，反应体系为40 μL，反应参数为：预变性94 ℃5 min；94 ℃1 min，57 ℃1 min，72 ℃1 min，共35 个循环；72 ℃终末延伸10 min，4 ℃暂时保存。PCR 扩增产物进行核酸凝胶电泳。将PCV2 阳性样品中同时扩增出4 条清晰明亮目的条带PCR 产物送上海英俊生物科技有限公司进行序列测定。

1.7 序列比对分析

利用DNAStar-SeqMan 拼接PCV2 全基因组序列，用DNAStar-MegAlign 和MEGA-X 比对分析扩增序列与GenBank 上已发布的PCV2 疫苗毒株、各基因型标准参考毒株、国内外不同国家和地区毒株（表2）的核苷酸同源性、遗传进化（树）；并对ORF2基因推导的Cap 蛋白氨基酸同源性和突变位点进行分析。

表2 PCV2 参考序列

2 结果与分析

2.1 疑似PCV2 鉴定

用PCV2 鉴定引物PCV2 F 和PCV2 R 对山西阳泉、柳林、平遥、泽州和高平的15 份疑似PCV2猪肺脏组织进行PCR 扩增和凝胶电泳，有12 份病料扩增出预期目的片段（图1），鉴定为PCV2 阳性样品。

2.2 PCV2 全基因的PCR 扩增

用4 对PCV2 全基因扩增引物分别对阳泉、柳林、平遥、泽州和高平12 份PCV2 阳性样品进行PCR 扩增和凝胶电泳，共有6 份阳性样品同时扩增出4 个预期的目的片段（图2）。

2.3 测序基因的拼接与命名

将同时获得4 个目的片段的PCR 扩增产物进行测序，用DNAStar-SeqMan 拼接基因，获得6 株PCV2 全基因序列，分别命名为SXYQ-1、SXLL-2、SXZZ-3、SXZZ-4、SXGP-5、SXPY-6。其中SXYQ-1、SXLL-2、SXZZ-3、SXZZ-4 有1767 个核苷酸，SXGP-5、SXPY-6 有1 768 个核苷酸。

2.4 全基因遗传进化分析

应用DNAStar-MegAlign 对6 株PCV2 全基因进行遗传进化分析和比较。6 株之间核苷酸同源性为96.6%～99.9%。与GenBank 上已发布的国内外疫苗株同源性为95.4%～98.7%，与国内、国外其他毒株同源性分别为95.4%～99.8%和94.6%～99.8%。与山西太原毒株（KX352155）同源性为95.5%～95.8%。

应用MEGA-X 对6 株PCV2 全基因进行进化树分析可知（图3），6 株PCV2 处在2 个不同的进化分支上，SXYQ-1、SXLL-2、SXZZ-3、SXZZ-4、SXGP-5处在同一分支上，属于PCV 2b 型；SXPY-6 处于另一分支上，属于PCV 2d 型。

2.5 ORF2 基因遗传进化分析

应用DNAStar-MegAlign 软件对6 株PCV2ORF2基因进行遗传进化分析和比较。6 个ORF2 基因序列长度均为702bp。6 株之间核苷酸的同源性为94.8%～99.9%，与GenBank 上已发布的国内外疫苗株同源性为92.3%～99.0%，与国内、国外其他毒株同源性分别为91.5%～99.9%和91.8%～99.9%。与山西太原毒株（KX352155）同源性最低，为91.5%～92.8%。

应用MEGA-X 对6 株PCV2 ORF2 基因进行进化树分析（图4），6 株处在2 个不同进化分支上。SXYQ-1、SXLL-2、SXZZ-3、SXZZ-4、SXGP-5 处 在同一分支上，属于PCV 2b 型；SXPY-6 处于另一分支上，属于PCV 2d 型。

2.6 ORF2 基因推导Cap 蛋白氨基酸分析

应用DNAStar-MegAlign 分析6 株PCV2 的ORF2 基因推导的Cap 蛋白氨基酸序列（图5）。6 株PCV2 的Cap 蛋白均为233 个氨基酸，其氨基酸同源性为94.0%～100%；与参考毒株Cap 蛋白氨基酸同源性为88.0%～100%，与国内外疫苗株同源性为90.6%～100%。Cap 蛋白氨基酸主要变异位点分析表明，氨基酸主要变异区域为57—90、121—135、190—210，在8、47、169、232、234 等处存在一些散在的变异位点。在86—90 位SXPY-6 有PCV 2d 特有的Cap 蛋白氨基酸序列SNPLT，属于PCV2d 型；其余5 株在86—91 位有PCV 2b 特有的Cap 蛋白氨基酸序列SNPRS，属于PCV 2b 型。

3 结论与讨论

近年来，PCV2 在欧洲、美洲等一些国家和地区持续不断存在，国内有关PCV2 的报道不断增加，PCV2 引起的圆环病毒病给养猪业造成了巨大的经济损失[8，17]。

通过对不同地区的PCV2 毒株的序列分析、比对，可以了解PCV2 的遗传与进化，对疫苗的研发和选用具有重要意义。本研究从山西省部分地区疑似PCV2 病料中扩增测序获得6 株PCV2 完整序列，其中，2 株核苷酸为1 768 bp、4 株核苷酸为1 767 bp，与GenBank 上已发布的国内外PCV2 株同源性为94.6%～99.8%，表明山西省内流行的PCV2毒株与目前国内外流行的毒株序列同源性很高；6 株PCV2 的ORF2 基因序列与GenBank 上已发布的国内外毒株进行序列比对同源性为91.5%～99.9%，表明PCV2 的ORF2 基因比全基因组变异程度较高；综合PCV2 全基因和ORF2 基因同源比对结果，表明山西省内PCV2 基因存在一定程度的变异。另外，本研究还发现，按Cap 蛋白氨基酸在86—89 位的特定序列分型，与全基因和ORF2 基因分型相一致，和李文良[18]对于PCV2 各个基因型Cap蛋白在86—89 位有特定序列的结果相一致。

本研究得到的6 株序列按全基因或者ORF2基因分型，5 株属于PCV 2b 型、1 株属于PCV 2d型，可以初步判断山西省目前流行的圆环病毒2 型以PCV 2b 型为主。本研究只选择了山西晋中、晋南和晋北5 个地方的样品，测得的基因序列数目有限，对于PCV2 在山西省的流行情况，需要进一步加大对PCV2 基因型变异的监测力度，以便为PCV2 疫苗基因型选择、疫苗研发和山西省PCV2防控提供依据。