研究循环肿瘤细胞检测在卵巢上皮性肿瘤中的应用进展

余盛权 黄浩

摘要：目的：卵巢上皮性癌（EOC）发病隐匿，早期診断困难，易发生侵袭及转移，发展迅速，确诊时往往处于疾病晚期。因此，研究卵巢癌细胞恶性生物学行为的分子机制尤为重要。近年来，循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells， CTCs）检测技术取得了快速发展，对恶性肿瘤辅助诊断、疗效评价、预后监测等具有重要的指导作用。本研究分析CTCs在EOC的研究进展。

关键词：卵巢上皮性;循环肿瘤细胞检测;恶性肿瘤

妇科恶性肿瘤中，卵巢癌死亡率最高，且发病率呈逐年上升，全球每年卵巢癌新发病例达20万，死亡率高达14万[1]。卵巢癌死亡率高的原因之一是大多数患者在确诊时已经出现转移[2]。卵巢癌发病隐匿，早期诊断困难，易发生侵袭及转移，确诊时患者通常处于疾病晚期。晚期卵巢癌五年生存率仅为20%，早期患者可达85%～90%[3]。液体活检（Liquid BioPsy， LB）微创技术快速发展，利用高通量测序技术检测脱落进入血液的肿瘤细胞或其DNA、RNA。相较于传统的组织活检，具有操作简便、可重复性好、无创、非侵入性等优势[4]。该项技术是通过检测血液或尿液等体液中某些生物活性分子，从而做出诊断。目前，临床上产前筛查所使用的无创基因检测即为液体活检的标志性应用之一。液体活检常见的检测项目包括循环肿瘤DNA（Circulating Tumor DNA，CT DNA）、循环肿瘤细胞（Circulating Tumor cell， CTCs）[5]及肿瘤细胞来源的外泌体（Tumor Cell-Drived Exosomes， TEXs）[6]。

1 CTCs概述

CTCs指存在于外周血中各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落，大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。目前应用最多的CTCs检测方法是美国Veridex公司研发的专有技术CellSearchTM。CTCs对肿瘤早期诊断、临床分期、疗效监测及预后判断有重要临床价值，还可为肿瘤个体化治疗提供临床指导。CTCs有望成为一种新的标记物来动态监测卵巢肿瘤，近几年来备受研究者关注。

2 CTCs生物学特性

CTCs是从原发肿瘤病灶脱落后进入外周血，故CTCs与原发肿瘤形态特征具有相似性，例如细胞体积大，核质比高，不容易变形，细胞核呈颗粒状或斑点状等。Choi等[7]对卵巢癌细胞系OVCAR-3进行研究发现，癌细胞的体积大于白细胞，直径为16～25 μm，而白细胞直径为7.3～11.2 μm。

3 CTCs的作用机制及原理

CTCs的出现被认为是恶性肿瘤血行转移的重要始发事件。肿瘤患者生存期短原因主要是肿瘤复发转移，但转移扩散机制还远未阐明。肿瘤转移主要包括两种转移模式。

（1）上皮-间质转化（EPithelial-Mesenchymaltransition， EMT）及间质-上皮转化 （Mesenchymal-to-EPithelial Transition， MET）。各种癌性肿瘤来源于上皮组织，这些组织由强烈极化的上皮细胞形成，并通过强烈的细胞间和细胞间细胞外基质粘附而连接[8]。传统模型是单个肿瘤细胞依赖上皮间质细胞转化（EMT），即原发肿瘤上皮细胞获得脱离原发病灶的能力，进而浸润周围组织进入血液形成CTCs，逃逸机体免疫，建立新的肿瘤微环境，在患者其他组织器官通过间质上皮转化（MET）形成新的转移灶[9]。原发肿瘤细胞通过EMT方式，可形成以上皮型（E>M）、间质性（M>E）为主体和少量同时具备上皮和间质型（E=M）的肿瘤细胞共存的局面。相关研究显示，血液中存在较多的间质性CTCs可表明转移复发的机率大大增高[10]。肿瘤远处转移很可能在肿瘤发展早期就已经出现，因此CTCs检测具有重要临床意义。早期发现血液中CTCs，对于患者疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。然而，CTCs占据转移器官形成临床转移灶的过程需要许多肿瘤微环境支持，因此研究CTCs在肿瘤转移中的相关机制较困难，需要结合肿瘤细胞的血液循环系统和肿瘤微环境的变化。

（2）原发肿瘤呈链状、团状或聚集成细胞簇的形式侵袭周围组织，向损伤的血管内灌注，同时吸引血细胞形成微血栓，与单个CTCs相比存活力更强、外渗速度更快、侵袭力更强[11]。CTCs形成的细胞团簇常附着血小板，能刺激分泌转化生长因子β（Transforming Growth Factor β， TGF-β），参与炎症介质和生长因子的调节，促进器官的炎症反应而引起血管高渗，从而使CTCs渗出血管发生器官转移;又可协同血液循环中的叉头框蛋白C1（Forkhead -Box Protein C1，FOXC1）转录因子，促进肿瘤细胞表型转化，这种转化方式在肿瘤转移初期起着重要作用，同时也与疾病预后密切相关。

4 CTCs在卵巢癌中的临床应用

4.1 CTCs对卵巢癌患者指导诊断及治疗作用

目前，卵巢癌最常用的血清学标志物为癌抗原125（CA125）与人附睾蛋白（HE4），但两者单独检测缺乏特异性及敏感性，CTCs检测为患者提供了一种更为方便、精准及无创的检查方法。临床上定义外周血CTCs≥2个/7.5 ml为CTCs阳性。近年来，Liu等采用Cellsearch系统对78例新诊断或复发性卵巢癌患者的检测发现，超过80%患者中可检测到至少1个CTC，但CTCs数量和临床病理特征均无相关性。

4.2 CTCs在卵巢癌中疗效监测及预后作用

CTCs是术后唯一能反映肿瘤特征的检测指标，目前卵巢癌化疗期间通过动态监测CTC来反映治疗效果及有无耐药研究较少。丁凌雁等利用流式细胞仪收集60例晚期卵巢癌（Ⅲ～Ⅳ期）患者化疗2周期前后CTC，结果显示，化疗后患者CTCs减少，且提示CTCs减少的患者较外周血CTCs计数≥5的患者平均无进展生存期（PFS）延长约6个月，表明CTCs与患者化疗疗效及预后有关，通过CTCs阳性率可间接预测卵巢癌患者的疗效，与RECIST评价疗效比较，CTCs可以实时监测治疗疗效，对卵巢癌患者个体化治疗具有指导意义。此外，CA125是卵巢癌常用肿瘤标记物，用于卵巢癌诊断、治疗和预后评估。研究表明CA125和CTCs都可以提供转移性卵巢癌患者预后信息。Ning等研究发现，CTCs计数与血清CA125水平呈正相关（r=0.309，P=0.035），在13例CTCs计数>2个/3.75 ml的卵巢浆液性癌患者中有10例CA125>70 kU/L，CTC可以作为卵巢癌早期诊断指标，CTC检测与卵巢癌早期诊断、分期预测有一定相关性。在上述以CTC作为监测治疗指标中，无论是与常规影像学评估还是血清学肿瘤标记物比较，都显示CTC在监测治疗中的优势。

CTCs有评估预后或预测生物标志物作用。据相关研究，Zeng等分析表明，卵巢癌外周血中CTCs陽性组比阴性组有更短的总生存期（OS）和PFS。ZHOU等在Meta分析中汇集11篇文献，囊括1129例卵巢癌患者，指出与CTCs阴性组相比，CTCs阳性组患者OS、PFS及无病生存期（DFS）更短，且指出CTCs的存在与血清肿瘤标志物CA125有关。再次提示CTCs可作为监测卵巢癌预后的指标之一。

5问题与展望

目前，CTCs临床意义已在多种类型实体肿瘤中得到有效评价，尽管其检测正逐步应用于临床，但还存在以下不足：目前找寻外周血CTCs方式有限，尚未统一检测标准;检查费用高昂，经济实用性欠佳;多数研究无法证明CTCs在外周血释放规律，且无大数据随访患者相关生存期及疗效。上述原因可能会影响CTCs检测在临床广泛应用。但通过CTCs检测不断探索、更新及大样本数据临床试验的逐步开展，若能统一CTCs相关抗原标记物，增加其敏感性及特异性，逐步降低检测费用，CTCs检测在卵巢恶性肿瘤中临床使用前景及实用价值将得到进一步提升。虽然已有报道检测CTCs分子标志物，但由于成本高以及操作技术尖端复杂并没有广泛应用。此外CTCs检测方法及灵敏度直接影响结果评估，研究结果差异与CTCs检测方法、效率相关，目前CTCs的检测技术有很多，其操作简易度、成本、灵敏度还有待进一步研究和提高。尽管在卵巢癌中CTCs研究不多，也缺乏大样本的临床研究，但仍然值得进一步探索。综上所述，CTCs可作为辅助诊断卵巢疾病良恶性、疗效监测、评估预后的一项重要临床指标，未来将大大地提高和改善卵巢癌患者生存质量，为卵巢癌患者带来福音。

参考文献

[1]AliPour S，Zoghi S，Khalili N，et al.SPecific immunotheraPy in ovarian cancer： a systematic review[J]. ImmunotheraPy，2016，8（10）：1193-1204.

[2]Pignata S，Cecere S C，Bois A D，et al.Treatment of recurrent ovarian cancer[J]. Annals of Oncology，2017，28（s8）：viii51-viii56.

[3]Siegel R L，Miller K D，Jemal A.Cancer statistics，2016[J].CA：A Cancer Journal for Clinicians，2016，66（1）：7-30.

[4]Cheng X，Zhang L，Chen Y，et al.Circulating cell-free DNA and circulating tumor cells， the "liquid bioPsies" in ovarian cancer[J].Journal of Ovarian Research，2017，10（1）：75.

[5]Fernandez-Cuesta L，Perdomo S，Avogbe P H，et al.Identification of Circulating Tumor DNA for the Early Detection of Small-cell Lung Cancer[J].EBioMedicine，2016（10）：117-123.

[6]Sharma， S.et al.Tumor-derived exosomes in ovarian cancer - liquid bioPsies for early detection and real-time monitoring of cancer Progression.Oncotarget， 2017.8（61）：104687-104703.

[7]Choi H ，Kim K B，Jeon C S，et al.A label-free DC imPedance-based microcytometer for circulating rare cancer cell counting[J]. Lab on A ChiP， 2013， 13（5）：970-977.

[8]Liberko M ，Kolostova K，Bobek V.Essentials of circulating tumor cells for clinical research and Practice[J].Critical Reviews in Oncology Hematology， 2013， 88（2）：338-356.

[9]赵荣志.上皮细胞间质化与肿瘤的转移[J].中国肺癌杂志，2011，14（7）：5

[10]张骞，李力.循环肿瘤细胞在卵巢癌预测和预后中的应用价值[J]. 国际妇产科学杂志， 2018，45（6）：7.

[11]Fabisiewicz A.CTC clusters in cancer Progression and metastasis[J].Medical Oncology，2017，34（1）：12.