QuEChERS-SPE-高效液相色谱法测定饲料中乙氧酰胺苯甲酯的含量

宋 荣， 索德成， 李丽蓓， 范 理

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京100081）

乙氧酰胺苯甲酯是一种与盐酸氨丙啉、 磺胺喹噁啉等抗球虫药配伍使用的球虫抑制药物，自身具有抗原虫活性， 通过阻断四氢叶酸的合成阻止裂殖体的正常发育而发挥作用， 对巨型艾氏球虫和布氏艾氏球虫以及其他小肠球虫具有较好的抗虫活性（丁佳雯等，2004）。农业农村部允许使用的饲料药物添加剂品种目录中规定了含乙氧酰胺苯甲酯的药物预混剂的使用规范。

乙氧酰胺苯甲酯检测方法有分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法等（王淑芬等，1997；Ishiguro 等，1991；Robert 等，1978；Leonard 等，1977）。 由于气相色谱法需要在测定前将乙氧酰胺苯甲酯进行衍生，方法繁琐，所以饲料中乙氧酰胺苯甲酯的检测分析多采用液相色谱法（刘发全等，2019）。饲料中乙氧酰胺苯甲酯的净化方法包括液液分配、 溶剂转换或固相萃取方法等，由于液液分配方法有机溶剂量较大、 操作复杂，溶剂转换方法适合于简单基质净化，因此，目前复杂基质的净化多采用固相萃取柱（SPE）净化，填料有中性氧化铝 （Hibino 等，2000；Hikichi 等，1995；Hikichi 等，1993；Ishiguro 等，1981；Leonard等，1977）、碱性氧化铝（Dousa 等，2001）、弗罗里硅土（Hikichi 等，1993）等，这些固相萃取柱可去除样品中极性杂质。 QuEChERS 是一种用于农产品检测的快速样品前处理技术，利用吸附剂填料与基质中杂质的相互作用达到去除杂质净化样品的目的。本文采用QuEChERS 技术结合中性氧化铝固相柱净化方法， 有效去除饲料中极性、非极性、离子态等多种杂质，旨在提高净化效果，降低色谱响应本底，提高饲料中乙氧酰胺苯甲酯检测灵敏度、准确度和精密度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 乙氧酰胺苯甲酯 （纯度≧99.5%），中国兽医药品监察所；甲醇、正己烷、乙腈、丙酮（色谱纯），Fisher 公司；乙腈、无水硫酸镁、氯化钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；乙二胺-N-丙基吸附剂（PSA，粒径40 μm）、十八烷基键合硅胶吸附剂（C18，粒径40 μm）、中性氧化铝固相萃取柱（1000 mg/6 mL），美国Agilent公司；QuEChERS 盐析剂制备：4 g 无水硫酸镁，1 g氯化钠， 混合均匀；QuEChERS 净化剂制备：0.5 g无水硫酸镁，0.8 g 乙二胺-N-丙基吸附剂，0.6 g十八烷基键合硅胶吸附剂，混合均匀。

1.2 仪器与设备 1100 型高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；3K15 型离心机， 美国Sigma 公司；BS224S 型电子天平，德国赛多利斯公司；GenPure UV-TOC 型高纯水发生器，美国赛默飞世尔公司；SK7200LHC 型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；Vortex TM-1 型涡旋振荡器， 德国WIGGENS 公司；24 孔固相萃取装置，美国Supelco 公司；MG-2200 型氮气吹干仪（带加热装置），温 度 可 控 制 在 （50 ±2）℃， 日 本 TOKYO RIKAKIKAI 公司。

1.3 标准溶液制备

1.3.1 标准储备溶液 称取10 mg 乙氧酰胺苯甲酯标准品，用甲醇（色谱纯）配制成浓度为100 μg/mL的乙氧酰胺苯甲酯标准储备溶液，2 ～8 ℃保存，有效期为2 个月。

1.3.2 标准系列工作溶液 准确吸取适量乙氧酰胺苯甲酯标准储备溶液，用甲醇（色谱纯）配制成浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL 乙氧酰胺苯甲酯标准系列工作溶液，现用现配。

1.4 试样溶液制备 称取适量样品 （配合饲料、精料补充料、浓缩饲料约2 ～3 g，预混合饲料约0.5 ～1 g）， 精确至0.0001 g， 置于50 mL 离心管中，加约等量的水润湿样品，准确加入20 mL 乙腈，振摇混匀，超声提取30 min，期间振摇数次。超声后加入5 g QuEChERS 盐析剂，混匀，静置片刻，10000 r/min 离心10 min； 移取8 mL 上清液，加入1.9 g QuEChERS 净化剂，混匀1 min，4000 r/min 离心10 min； 准确移取5 mL 上清液，（50±2）℃氮气吹干，5 mL 正己烷（色谱纯）+丙酮（色谱纯）= 95+5 溶液溶解， 该溶液全部通过用10 mL正己烷（色谱纯）已活化好的中性氧化铝固相萃取柱，5 mL 正己烷（色谱纯）淋洗，抽干，6 mL 甲醇（色谱纯）洗脱。收集洗脱液，将洗脱液（50±2）℃氮气吹干。 准确加入1 mL 甲醇（色谱纯）溶解，用0.45 μm 微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱分析。1.5 液相色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18 柱，长度250 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm；柱温：30 ℃；流动相：乙腈+水=3+7；流速：1.0 mL/min；激发波长：306 nm，发射波长：350 nm；进样量：10 μL。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择 饲料中乙氧酰胺苯甲酯提取溶剂主要有水、 甲醇（或） 乙腈及其混合溶液。Leonard 等（1977）发现，提取液中水的比例控制在20%以内可以减少干扰色谱的共提取物。 本实验比较了80%甲醇、 甲醇和乙腈对添加8 mg/kg 乙氧酰胺苯甲酯的肉鸡配合饲料的提取效率，结果见图1。

图1 三种提取溶液对鸡配合饲料中乙氧酰胺苯甲酯的提取回收率（n=3）

图1 表明，80%甲醇、甲醇和乙腈3 种提取溶液对含8 mg/kg 乙氧酰胺苯甲酯的肉鸡配合饲料的提取回收率分别为94%、89.3%和82.6%，80%甲醇提取效率高于甲醇，也高于乙腈，表明含一定比例水的提取液可有效提高提取效率。

2.2 样品净化方法的选择和优化

2.2.1 QuEChERS 净化 水润湿饲料样品在提高提取效率的同时会提取出共存杂质， 从饲料基质特点出发， 本实验采用QuEChERS 技术，对QuEChERS 净化剂组成和用量进行研究。 采用无水硫酸镁去除水分，PSA 吸附剂去除阴离子杂质，C18 吸附剂去除非极性杂质， 并通过少量多次考量净化剂用量。 提取液中每加入0.2 g 吸附剂，混匀离心后观察吸附剂层颜色的变化，PSA 吸附剂层因PSA 与阴离子杂质结合而变成墨绿色，当PSA 累计用量达到0.8 g 时，PSA 吸附剂层颜色不再变化，据此确定PSA 吸附剂用量为0.8 g。 采用同样的方法，以C18 吸附剂层颜色不再变成黄色确定C18 吸附剂用量为0.6 g。

2.2.2 固相萃取柱净化 对经QuEChERS 净化、氮吹浓缩，再次溶解后得到的溶液，比较使用或不使用中性氧化铝固相萃取柱的净化效果。 实验发现不使用中性氧化铝净化的色谱本底明显高于使用中性氧化铝固相萃取柱的色谱本底。 同时比较了中性氧化铝和强阳离子交换柱（MCX 柱）两种固相萃取柱的净化效果， 结果表明中性氧化铝柱净化后的色谱本底远低于MCX 净化后的色谱本底，据此本实验采用QuEChERS 净化剂结合中性氧化铝固相萃取柱的净化方式。 在确定了净化方式后， 对中性氧化铝固相萃取所用洗脱溶剂进行研究，比较了甲醇和正己烷+丙酮（6+4）两种洗脱溶剂对0.3 mg/kg 和0.6 mg/kg 两个添加浓度样品吸附在中性氧化铝柱上的乙氧酰胺苯甲酯的洗脱能力，结果见图2。

图2 洗脱溶剂洗脱能力测定结果（n=4）

图2 表明，甲醇和正己烷+丙酮（6+4）对中性氧化铝柱上乙氧酰胺苯甲酯的洗脱能力存在差异，甲醇的洗脱效力高于正己烷+丙酮（6+4），由此本实验采用甲醇作为中性氧化铝柱的洗脱溶液。

2.3 标准溶液线性和标液稳定性 乙氧酰胺苯甲酯标准工作溶液，7 次测定峰面积见表1， 线性相关性见图3。 表1 中乙氧酰胺苯甲酯标准溶液浓度和色谱峰面积相关系数大于0.999。采用标准物质稳定性统计检验直线拟合法对标液稳定性进行考察，对7 次测定乙氧酰胺苯甲酯特征浓度（20 μg/mL）的色谱峰面积进行线性拟合，所得斜率用t 检验进行考察 （计算公式见GB/T 15000.3-2008），前6 次测定的峰面积通过t 检验，第7 次测定未通过检验。 从而确定乙氧酰胺苯甲酯标准储备液有效期为2 个月。

2.4 方法适应性 12 种动物饲料中乙氧酰胺苯甲酯添加回收实验结果见表2。 从表2 看出，畜禽动物配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料和反刍动物精料补充料中乙氧酰胺苯甲酯添加回收率为80% ～120%，相对相差≤15%。

表1 乙氧酰胺苯甲酯标准曲线的测定

图3 乙氧酰胺苯甲酯标准工作液线性相关图

表2 方法适应性考察实验（n=2）

2.5 方法回收率和精密度 在确定样品前处理方法后，用各类空白饲料样品做为测试对象，进行加标回收率实验，以考察方法的回收率和精密度。4 种饲料中乙氧酰胺苯甲酯3 个浓度水平3 次测定的添加回收实验结果见表3， 平均回收率为89.9% ～ 102.9% ， 批内变异系数为0.31% ～6.33%，批间变异系数为2.74% ～ 6.50%。4 种饲料的空白和添加样品色谱图见图4。

样品名称添加浓度/（mg/kg）测定批次回收率/%1 2 3 4 5 6平均回收率/%批内变异系数/%批间变异系数/%Ⅰ90.3 94.3 98.3 91.0 102.3 103.0 96.5 5.73 0.30 6.50肉鸡配合饲料5.00 4.00 8.00ⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ106.3 106.3 99.7 88.3 91.7 87.7 94.8 96.0 96.0 101.6 101.8 98.4 101.4 101.4 101.2 90.8 92.0 91.9 97.0 97.6 97.4 95.9 102.3 101.0 99.7 96.7 91.2 98.6 100.8 91.5 97.6 104.0 104.3 95.3 101.9 90.7 90.3 90.9 91.6 92.0 93.6 98.8 101.2 100.1 102.8 102.8 101.7 91.3 91.0 91.4 97.6 97.9 97.5 98.8 99.4 100.2 4.34 3.54 2.40 1.62 0.84 0.52 0.31 2.84 4.26 92.0 94.5 95.5 99.5 98.0 97.0 96.1 2.78 20Ⅱ93.593.5 93.094.591.594.593.4 1.19 3.97Ⅲ 100.0 103.0 101.0 102.5 100.5 102.0 101.5 1.17Ⅰ 100.0 98.7 100.0 96.7 96.7 96.7 98.1 1.67肉鸡浓缩饲料 30 Ⅱ 94.0 94.3 93.7 98.0 97.3 98.3 95.9 2.24 4.63Ⅲ87.3 87.3 92.7 98.3 99.0 86.0 91.8 6.33Ⅰ94.5 94.5 94.5 100.5 102.5 101.3 98.0 3.93 40Ⅱ92.592.5 98.892.598.8100.595.9 3.97 3.74Ⅲ92.8 95.5 92.8 99.0 101.0 99.5 96.8 3.68Ⅰ87.3 87.0 91.3 96.0 93.0 93.7 91.4 3.61 0.30Ⅱ100.7102.3 104.3102.7102.0100.7102.1 1.33 5.58Ⅲ91.3 95.0 97.7 99.7 98.0 102.7 97.4 4.02Ⅰ90.0 91.6 82.4 90.8 91.4 93.0 89.9 4.22奶牛精料补充料 5.00 Ⅱ 101.6 100.6 101.8 104.6 91.6 93.4 98.9 5.25 6.16Ⅲ99.0 93.4 101.4 100.2 99.6 102.0 99.3 3.10Ⅰ92.0 96.8 85.8 88.5 87.5 93.5 90.7 4.57 8.00Ⅱ100.4102.0 103.5101.8101.3104.1102.2 1.35 5.80Ⅲ98.1 99.0 100.6 101.4 99.5 100.3 99.8 1.19Ⅰ100 2.74产蛋鸡预混合饲料200 4.99 500ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ97.5 98.8 98.8 97.5 98.5 98.0 98.2 94.1 96.7 96.9 94.5 93.5 93.8 94.9 92.0 95.5 95.5 90.3 91.4 94.0 93.1 99.5 101.5 102.0 101.5 101.5 101.5 101.2 97.0 97.0 100.0 100.0 91.5 90.5 96.0 88.5 93.5 94.0 93.5 88.5 92.5 91.8 93.4 93.2 93.8 89.4 89.8 89.6 91.5 95.2 100.0 97.0 96.4 100.4 98.8 98.0 100.6 98.6 98.6 100.2 100.8 99.6 99.7 0.62 1.58 2.37 0.87 4.28 2.79 2.33 2.13 0.97 4.15

2.6 定量限 根据10 倍信噪比对应的乙氧酰胺苯甲酯含量， 在以上4 种空白饲料样品进行添加回收率实验，结果表明样品中0.3 mg/kg 添加浓度回收率和精密度能达到定量要求， 所以本方法定量限为0.3 mg/kg。

3 结论

本文建立了水润湿，乙腈提取，QuEChERS 技术和中性氧化铝固相萃取净化， 荧光检测器测定饲料中乙氧酰胺苯甲酯的高效液相色谱方法。 该方法适用于饲料复杂基质的净化， 方法各项性能指标达到日常检测分析的要求， 为饲料中乙氧酰胺苯甲酯使用的监管提供检测手段。

图4 空白和添加样品中乙氧酰胺苯甲酯的液相色谱图