零陵香总黄酮提取工艺优化

唐 森， 杨舒茵， 谢济运， 吴国勇， 张 鹏*

（1.广西科技师范学院食品与生化工程学院，广西来宾546199；2.广西科技师范学院特色瑶药资源研究与开发重点实验室，广西来宾546199；3.广西科技师范学院实验实训中心，广西来宾546199）

零陵香为报春花科植物零香草的干燥全草，又称为灵香草、香草、排草、佩兰等。主产于广西金秀、融水等地，始载于《嘉佑本草》，味属辛、甘（张智圆等，2013）。水煎液具有祛风解表、行气止痛的功能，多用于头痛鼻塞、胸闷腹胀、齿痛等症状（周博，2011）。由于零陵香具有香气，以往对其化学成分的研究多集中于石油醚、乙酸乙酯、乙醚、甲醇等脂溶性部位，报道成分种类以脂肪酸、黄酮苷、三萜为主（唐雪阳等，2017；闫旭宇等，2017；楼凤昌等，1989）。 但对于零陵香总黄酮提取工艺鲜有研究。本研究采用微波辅助提取零陵香总黄酮，以期通过响应面分析法将零陵香总黄酮提取工艺得到最大优化，提高零陵香原料的利用率。

1 材料与方法

1.1 试验材料 零陵香，购于亳州市众益堂中药材销售有限公司， 经广西科技师范学院特色瑶药资源研究与开发重点实验室鉴定为零陵香； 芦丁（超纯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢均为分析纯，西隆科学股份有限公司。

1.2 仪器与设备 FW135 型中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；FA2004B 型电子分析天平，上海越平科学仪器有限公司；XH-MC-1 型祥鹄微波合成反应仪，北京祥鹄科技发展有限公司；KQ-300DB 型数控超声波清洗器， 昆山市超声仪器有限公司；SHZ-D（III）型循环水多用真空泵，巩义市科瑞仪器有限责任公司；C-20 型玻璃仪器气流烘干器，上海贝仑仪器设备有限公司；UV-9600型紫外/可见分光光度计，北京北分瑞利分析仪器（集团）公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线 参照王宗成等（2016）的方法，以芦丁为标准品，采用NaNO2—Al（NO3）3—NaOH法测定芦丁含量并绘制标准曲线，Y=11.966X-0.0096，R2=0.9993，表明线性关系良好。

1.3.2 零陵香总黄酮的提取及测定 用电子天平准确称取1.00 g 零陵香粉末至于圆底三颈烧瓶中，加入一定体积分数的乙醇作为溶剂，用筛子塞住瓶口，浸泡30 min。 按照试验方案调整相应的液料比、微波时间、微波功率、乙醇体积分数进行提取，待样液冷却至室温后，进行真空抽滤，再移至容量瓶定容， 得到试验待测溶液。 精密移取2 mL 供试品稀释溶液至10 mL 具筛比色管中，加入5% NaNO20.3 mL，摇匀，静置6 min，加入10%Al（NO3）30.3 mL，摇 匀，静 置6 min，加 入10%NaOH 3.0 mL，摇匀，静置15 min。 用分光光度计在最大吸收波长（510 nm）处测定吸光度值（A）。计算零陵香黄酮得率。 将吸光度（A）代入，得到芦丁回归方程， 可得测定的供试品稀释溶液的黄酮浓度（C），再计算出样品中黄酮得率：

式中：C为稀释后提取液中黄酮含量，mg/g；V为提取液体积，mL；N 为稀释倍数；M 为植物粉末质量，g；B 为吸取测定体积，mL。

1.3.3 黄酮提取的单因素试验 乙醇体积分数：称取零陵香粉末1.00 g 于三颈圆底烧瓶中，依次加入50 mL 乙醇体积分数为50%、60%、70%、80%和90%的乙醇，浸泡30 min。设定微波温度为60 ℃，微波时间为6 min，微波功率为600 W，进行微波提取零陵香总黄酮。

微波时间：称取零陵香粉末1.00 g 于三颈圆底烧瓶中， 加入50 mL 体积分数为70%的乙醇，浸泡30 min。 设定微波温度为60 ℃，微波时间分别为6、9、12、15、18、21 min， 微波功率为600 W，进行微波提取零陵香总黄酮。

微波功率：称取零陵香粉末1.00 g 放入250 mL三颈圆底烧瓶中，加入50 mL 体积分数为70%的乙醇溶液，浸泡30 min。 设定微波温度为60 ℃，微波时间分别为15 min， 微波功率为300、400、500、600、700 W，进行微波提取零陵香总黄酮。

液料比：称取1.00 g 零陵香粉末，分别加入液料比为40：1、50：1、60：1、70：1、80：1（mL/g），体积分数为70%的乙醇溶液，浸泡30 min。 设定微波温度为60 ℃，微波时间分别为15 min，微波功率为600 W，进行微波提取零陵香总黄酮。

1.4 响应面法优化试验设计 根据单因素试验结果， 分别选取相应的单因素： 乙醇体积分数（A）、微波时间（B）、微波温度（C）和液料比（D）为自变量（X），零陵香总黄酮含量为响应值（Y），再由Box-Behnken 的原理，设计4 因素3 水平的中心响应面试验，其中心点为最佳工艺条件，以此得到提取零陵香总黄酮的最优得率， 试验的响应面因素与水平见表1。

表1 响应面因素水平设计

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对零陵香总黄酮得率的影响由图1 可见，随着乙醇体积分数的提高，黄酮类化合物的得率不断升高。 乙醇体积分数为60% ～70%时，趋势最陡，黄酮得率变化最快。 但乙醇体积分数超过70%以后，黄酮得率逐渐平缓且呈下降趋势。 这是由于高浓度的乙醇造成了蛋白质的下降，使黄酮无法浸出，得率下降。另一方面，当乙醇体积分数提高时，溶液的颜色加深，零陵香样品里的色素也因此被提取出来（杨帆等，2018）。综合考虑零陵香总黄酮得率、能量资源消耗等因素，以乙醇体积分数为70%的溶液作零陵香总黄酮的最佳提取条件。

图1 乙醇体积分数对黄酮得率的影响

2.1.2 微波时间对零陵香总黄酮得率的影响 由图2 可知，零陵香总黄酮得率在微波时间为15 min时达最大值。 提取时间小于15 min 时，黄酮得率随时间的延长呈上升趋势，物质的热运动加快，使零陵香总黄酮能够更容易被提取出来。 但微波时间超过15 min 后，黄酮得率逐渐下降。 黄酮在高温条件下易发生氧化，提取时间过长，使黄酮得率反而降低；加热时间过短时，温度较低，不利于黄酮的提取（艾薇等，2018）。综合考虑零陵香总黄酮得率和能量资源消耗等因素，以微波时间为15 min作零陵香总黄酮的最佳提取条件。

图2 微波时间对黄酮得率的影响

2.1.3 微波功率对零陵香总黄酮得率的影响 由图3 可知，微波功率为600 W 时，零陵香总黄酮得率达最大值。 微波功率为300～600 W 时，黄酮得率随着微波功率的加大而升高，600 W 以后呈现下降趋势。 微波功率是微波能量的直接体现，在合适的微波功率范围内， 微波功率越大破壁效果越好。过大的微波功率虽然在初期有利于零陵香总黄酮的溶出，但是随后会产生局部过热现象，破坏黄酮的结构。 故选择600 W 的微波功率为最佳条件。

图3 微波功率对黄酮得率的影响

2.1.4 液料比对零陵香总黄酮得率的影响 由图4 可知，料液比为40 ～ 60 mL/g 时，黄酮得率随着液料比的增大而增大，60 mL/g 时黄酮得率最高。液料比小， 零陵香总黄酮在乙醇溶剂中的传质速率慢，得率小；综合考虑得率和能源消耗等因素，选择60 mL/g 为最佳液料比。

图4 液料比对黄酮得率的影响

2.2 响应面法优化试验结果

2.2.1 试验设计与结果 结合单因素试验得到的数据，确定乙醇体积分数（A）、微波时间（B）、微波功率（C）和液料比（D）4 个因素，以零陵香总黄酮得率（Y）为指标，设计5 个中心点，即A、B、C、D四个因素的水平均为“0”的重复试验，具体设计如表2。 在Design expert 软件进行回归分析，计算得零陵香总黄酮得率（Y）对乙醇体积分数（A）、微波时间（B）、微波功率（C）和液料比（D）的二元多项回归方程：Y=18.25+0.50A+0.095B+0.16C+0.10D+0.42AB +0.18AC +0.027AD -0.047BC -0.18AC -0.027AD-0.65A2-0.33B2-0.4C2-0.095D2。

由表3 分析结果可知，R2=0.9720， 表明响应值总黄酮得率的实际值与预测值之间的拟合度较高， 可以用来预测和优化零陵香总黄酮提取的工艺条件， 试验方法可信度较大。 而试验模型的P值＜0.0001，表明该模型回归有极显著差异；且失拟值P=0.0741（即P ＞0.05），差异不显著，建立模型数据成立。

由响应面分析结果中二次回归方程系数的显著性检验可知，一次项A（F=173.58）、二次项A2（F=158.37）、B2（F=41.30）、C2（F=61.06）和交互项AB（F=40.26）对试验结果有极显著性影响。 一次项B、C、D 和交互项AC、BD、CD 有显著性影响。综合以上因素分析， 表明考察因素对零陵香总黄酮的得率存在交互综合影响作用。 比较F 值大小可反映出各因素对指标的影响规律， 一次项影响零陵香总黄酮得率的主次因素为：A＞C＞D＞B，即乙醇体积分数＞微波功率＞液料比＞微波时间；交互项影响零陵香总黄酮得率的主次因素为：AB＞CD＞BD＞AC＞BC＞AD； 二次项影响零陵香总黄酮得率的主次因素为：A2＞C2＞B2＞D2， 即乙醇体积分数＞微波功率＞微波时间＞液料比。

表2 响应面试验设计与结果

2.2.2 等高线图和响应面分析 运用Design-Expert8.0.6 软件对零陵香总黄酮得率响应值分析作图， 得到由响应值A、B、C、D 四个因素所构成的三维空间图及其三维空间在二维平面上的等高线图。响应面坡度相对平缓，表明可以忍受处理条件的变异， 等高线图中同一椭圆形区域内表示得率相同，中心越高，越向边缘扩散越低，且椭圆曲线排列越紧密表明该因素对总黄酮得率影响越大。 同时，等高线越接近圆形，说明两因素交互作用越弱，越接近椭圆形，交互作用越显著。 分析结果见图5 ～ 10。

表3 响应面方差分析结果

由图5 可知，乙醇体积分数和微波时间的3D响应面图坡度较为陡峭， 表明响应值对这两种工艺条件的改变较为敏感， 等高线图中的等高线接近椭圆形， 说明乙醇体积分数和微波时间交互作用对零陵香总黄酮得率的作用效果更强。

图6 中3D 响应面图坡度相较于图5 更为平缓，等高线图也更接近圆形。表明在提取零陵香总黄酮的试验中， 乙醇体积分数和微波功率的交互作用比乙醇体积分数和微波时间交互作用的显著性更弱。

在图7 的三维响应面图中， 清晰的看到当乙醇体积分数固定时， 黄酮含量的趋势呈直线型递增，数值变化较小；当液料比固定时，随着乙醇体积分数的增大，黄酮得率变化较大且出现最大值。其等高线图接近圆形， 因此乙醇体积分数和液料比的作用效果不显著。

图5 总黄酮得率随乙醇体积分数和微波时间变化的响应面与等高线图

结合图8 的两个图可直观地看出， 随着微波功率的加大和微波时间的延长， 黄酮得率都呈现递增趋势，但两个因素的交互作用，使黄酮得率先增大后减小，响应面的坡度较为平缓，黄酮得率变化不大。 另这两个因素的等高线图趋近于圆形，所以微波时间和微波功率的交互作用对零陵香总黄酮得率的影响不显著。

从图9 可知， 液料比和微波时间的交互作用影响，黄酮得率先增大后减小，等高线图呈现椭圆状，表明液料比和微波时间的作用效果显著。

图6 总黄酮得率随乙醇体积分数和微波功率变化的响应面与等高线图

从图10 中的三维响应面图可以看出，微波功率的黄酮含量变化大于液料比； 其等高线图呈椭圆形，说明微波功率和液料比的交互作用显著，且微波功率的显著性大于液料比。

2.3 最佳条件的预测以及验证试验 运用计算机软件分析，预测出的最佳工艺条件为：乙醇体积分数74.52%， 微波时间17.39 min， 微波功率588.66 W，液料比68.41 mL/g，黄酮含量为18.51 mg/g，即黄酮得率为1.851%。 综合考虑试验结果、仪器条件和经济成本， 确定零陵香总黄酮最佳提取工艺条件为乙醇体积分数75%， 微波时间17 min，微波功率600 W，液料比68 mL/g。 通过3 次平行验证试验， 提取得到的零陵香黄酮含量为18.29 mg/g，即黄酮得率为1.829%。与预测值相差1.18%。 实际值与预测值非常接近，说明采用响应面方法得到的回归模型，结果真实可信。

图7 总黄酮得率随乙醇体积分数和液料比变化的响应面与等高线图

图8 总黄酮得率随微波功率和微波时间变化的响应面与等高线图

图9 总黄酮得率随微波时间和液料比变化的响应面与等高线图

图10 总黄酮得率随微波功率和液料比变化的响应面与等高线图

3 结论

本试验最终优化得到零陵香总黄酮提取的最佳工艺条件为：乙醇体积分数75%，微波时间17 min，微波功率600 W，液料比68 mL/g。 并且所得到的工艺条件参数可行性强，重复性好。