中风通络洗剂的质量标准研究

张文，黄春英，莫海涛，刘元

（1.玉林市中医医院，广西玉林537000；2.广西艳日辉瑶药瑶浴产品开发有限公司，广西南宁530219）

瑶族医药是祖国医学的一个重要分支，瑶浴是一种富有瑶族特色的防治方法，目前已列入“十一五”国家科技支撑计划“民族医药发展关键技术示范研究”项目。中风通络洗剂是根据广西金秀瑶族民间治疗中风后遗症（偏瘫）的有效验方制成，主要由麻骨钻（买麻藤）、半荷风（半枫荷）、地钻（千斤拔）、五爪风（五指毛桃）、血风（走马胎）、扁骨风（扁担藤）、九节风（肿节风）、粉葛等药材组成，具有疏风通络、活血、除痰的功效。方中朱砂根和走马胎的主要活性成分为岩白菜素，具有止咳祛痰和抗炎作用，并具有细胞毒活性［1-2］；肿节风具有祛风除湿、活血止痛的功效［3］；粉葛中活性成分葛根素具有显著的扩张冠状动脉、抗血栓、改善冠状动脉血流量的作用［4］。为能更好地控制中风通络洗剂的质量，本研究采用TLC法对方中朱砂根和走马胎、肿节风进行定性鉴别，采用HPLC法测定粉葛中葛根素的含量，为制订中风通络洗剂的质量标准提供了数据基础。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器LC3000I型高效液相色谱仪（北京创新通恒有限公司）；UV3000紫外检测器（北京创新通恒有限公司）；CXTH-3000色谱工作站（北京创新通恒有限公司）；Agilent-C18柱［4.6 mm×250 mm，5μm，安捷伦科技（中国）有限公司］；KQ5200E型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药岩白菜素对照品（批号：111532-201203）；肿节风对照药材（批号：121048-201205）；葛根素对照品（批号：110752-201615），购于中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余所用试剂均为分析纯。样品：中风通络洗剂，由广西艳日辉瑶药瑶浴产品开发有限公司和玉林市中医医院制剂室 提 供，批 号：180801、180802、180803、181119、181120、181121。

2 薄层色谱鉴别

2.1 朱砂根和走马胎的TLC鉴别

2.1.1 对照品溶液的制备取岩白菜素对照品，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备取本品10 ml，加甲醇20 ml，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。

2.1.3 阴性对照溶液的制备取缺朱砂根和走马胎的其他药材，按比例及制备方法制成阴性样品，取阴性样品10 ml，同“2.1.2”项方法制成阴性对照溶液。

照薄层色谱法［5］试验，吸取上述3种溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（5∶4∶2）为展开剂展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁-2%铁氰化钾（1∶1）溶液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点（Rf=0.51）。阴性无干扰。见图1。

图1 朱砂根和走马胎薄层色谱图

2.2 肿节风的TLC鉴别

2.2.1 对照药材溶液的制备取肿节风对照药材0.5 g，加水30 ml，超声处理30 min，滤过，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次25 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为对照药材溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备取本品30 ml，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次25 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备取缺肿节风的其他药材，按比例及制备方法制成阴性样品，取阴性样品30 ml，同“2.2.2”项方法制成阴性对照溶液。

照薄层色谱法［5］试验，吸取上述3种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（9∶4∶1）为展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点（Rf=0.52）。阴性无干扰。见图2。

图2 肿节风薄层色谱图

3 含量测定

3.1 色谱条件色谱柱：Agilent-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；检测波长：250 nm；流动相：甲醇-水（26∶74）；流速：1.0 ml/min；柱温：室温。理论塔板数按葛根素峰计应不低于4 000。

3.2 对照品溶液的制备精密称取葛根素对照品适量，加30%乙醇制成每1 ml含20μg的溶液，即得。

3.3 供试品溶液的制备精密量取本品溶液5 ml，置25 ml量瓶中，加30%乙醇15 ml，超声处理30 min，冷却至室温，加30%乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

图3 HPLC色谱图

3.4 阴性对照溶液的制备按中风通络洗剂处方和方法制备缺粉葛的阴性样品，再按“3.3”项方法制备阴性对照溶液。

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μl，按上述色谱条件进样分析，结果供试品各相邻峰分离良好，阴性对测定无干扰。色谱图见图3。

3.5 标准曲线及线性范围考察精密称取葛根素对照品9.73 mg，置25 ml量瓶中，用30%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成389.20μg/ml对照品溶液，备用。分别精密吸取上述对照品溶液0.25 ml、0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml，置10 ml量瓶中，加30%乙醇稀释至刻度，摇匀，分别进样测定。0.25 ml的稀释液进样2.5μl、5μl、10μl，其余进样10μl，测定，以葛根素对照品进样浓度（μg/ml）为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得回归曲线为Y=45 379X+7 975.6，相关系数r2=0.999 8。结果表明：葛根素进样量在0.024～0.778μg之间与峰面积积分值呈线性关系。

3.6 精密度试验分别精密吸取葛根素对照品溶液（19.46μg/ml）和供试品溶液（批号181120）各10μl，连续进样6次，依次测定峰面积值，即得。测得对照品RSD为1.42%（n=6），供试品RSD为1.30%（n=6）。

3.7 重复性试验精密量取同一批号供试品（批号181120）共6份，按“3.3”项下方法进行提取、测定，即得。结果测得葛根素含量为78.0μg/ml，RSD为1.26%（n=6）。表明该方法重复性良好。

3.8 稳定性试验取供试品溶液（批号181120），每隔2 h分别进样10μl测定，结果供试品的峰面积值RSD为1.30%（n=6），表明供试品溶液在10 h内保持稳定。

3.9 加样回收试验精密量取已测知含量的同一批号供试品溶液2.5 ml（批号：181120；含量：78.0μg/ml）6份，加入389.20μg/ml葛根素对照品溶液0.5 ml，按供试品制备项下方法进行提取，测定。结果葛根素平均 回收率 为99.0%，RSD为1.40%（n=6），结 果见表1。

3.10 样品测定取6批中风通络洗剂，按供试品溶液的制备及检测方法，测定其中葛根素的含量，结果见表2。

4 讨论

中风通络洗剂为民族药制剂，组方中大多数药材为广西特色瑶药，本研究以岩白菜素对照品和肿节风对药药材为标准品，采用TLC法对方中朱砂根、走马胎和肿节风进行定性鉴别，斑点清晰，重现性好，且阴性无干扰。但由于中国食品药品检定研究院没有更多的标准对照药材提供，定性试验还有待进一步深入。

表1 加样回收试验结果 （n=6）

表2 样品中葛根素含量测定结果 （n=2）

在定量测定中，采用了HPLC法测定粉葛中葛根素的含量，通过对葛根素对照品溶液进行紫外扫描，发现其在250.50 nm处有最大吸收，最后参照《中华人民共和国药典》2015年版粉葛项下含量测定方法［6］，选定检测波长为250 nm。以甲醇-水为流动相，考察了多种比例，最后确定甲醇-水（26∶74）的比例较为适合。采用超声处理30 min、加热回流1 h进行提取方法考察，二者含量测定结果差别不大，但超声处理更简便、快捷，故采用超声处理法。对甲醇、乙醇、30%乙醇3种提取溶剂进行考察，结果用30%乙醇提取所得葛根素的含量高，且节省溶剂，故采用30%乙醇作为提取溶剂。对10 ml、25 ml、50 ml提取溶剂量进行了考察，结果以25 ml进行提取，测得葛根素的含量高且节省溶剂，故采用25 ml作为提取溶剂量；对超声处理15 min、30 min、60 min 3种提取时间进行考察，结果超声处理15 min测得葛根素的含量较低，而30 min与60 min无明显差别，故提取时间定为30 min。