痰瘀同治法对动脉粥样硬化大鼠易损斑块的影响

靳宏光 朱星 李铁 王义强 成光宇

(长春中医药大学 1附属医院，吉林 长春 130021；2针灸推拿研究所)

动脉粥样硬化(AS)是一种常见慢性进行性全身性疾病，往往同时累及多处血管，严重影响人类健康，其病变的严重程度，主要取决于斑块的稳定性。目前认为，在AS过程中，斑块的易损性与炎性水平关系密切，且炎症反应是斑块易损过程中的主要驱动力，贯穿AS始终〔1〕。本实验从炎性因子角度观察具有痰瘀同治作用的参红通络方对AS大鼠主动脉易损斑块的影响，以期揭示该中药复方治疗AS的可能机制。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级雄性SD大鼠80只，体重(280±20)g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，许可证号SCXK(吉)2011-0004。饲养于吉林大学基础医学院动物饲养室，分笼饲养，大鼠自由饮水。饲养室温度控制在18～22℃，湿度控制在50%～70%，通风良好。基础饲料由20%面粉，3%米粉，25%玉米，25%麸皮，20%豆料，3%骨粉，4%鱼粉配制组成。高脂饲料由77%的基础饲料加入3%胆固醇，10%蛋黄粉，10%猪油构成。制备时先将基础饲料与胆固醇、蛋黄粉、猪油充分混合搅拌均匀后，加入适量开水制成模饼，用微波炉烤干。基础饲料、胆固醇、蛋黄粉、猪油均由吉林大学动物实验中心提供。

1.2药物、试剂、材料和仪器 中药方：参红通络方(主要由人参，红景天，丹参，水蛭，栝蒌，石菖蒲等药物组成)农本颗粒(吉林省莱沃药业有限公司)；辛伐他汀片(杭州默沙东制药有限公司，国药准字J20130068，规格20 mg/片)；低分子肝素钠(吉派林，杭州九源基因工程有限公司，国药准字 H19990035，规格0.3 ml/瓶)；青霉素钠(华北制药股份有限公司，国药准字H13020657，规格80万U/瓶)。血脂四项〔总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)〕试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20171111)；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒：sCD40L(天津安诺瑞康生物技术有限公司，批号208180418)、细胞间黏附分子(ICAM)-1(美国Cell Sciences 公司，批号20161018)、肿瘤坏死因子(TNF)-α(天津安诺瑞康生物技术有限公司，批号569180418)、白细胞介素(IL)-1β(天津安诺瑞康生物技术有限公司，批号370180611)，ACS-H1电子天平、电子计重秤AWH(SI)、4K15低温高速离心机、小型台式离心机、酶标仪、AB×51型OLYMPUS光学显微镜、Olympus PM-10AO全自动显微照相装置、HH·W21·600电热恒温水浴箱、LKB～V型超薄切片机、病理摊烤片机、JEDA801D形态学图像分析系统。

1.3方法 实验动物在适应性喂养1 w后，采用随机数字表法分为假手术组、模型对照组、中药低剂量组、中药高剂量组、辛伐他汀组，每组各16只。球囊损伤术：除假手术组只结扎颈外动脉，不行球囊损伤术，其余各组大鼠均用球囊损伤主动脉。所有大鼠麻醉后，仰卧固定，颈部备皮，取颈部正中偏左3 mm切开皮肤，切口长2.5～3.5 cm，钝性分离皮下组织与肌肉。在左侧颈总动脉，下穿两根4号丝线，结扎远端，另一根线放置近端备用。在靠近血管远端结扎处，剪开一“V” 形小口。假手术组直接在小口近心端结扎，其余各组大鼠用准备好的球囊沿小口处插入颈外动脉，继续顺着血管往下插，经过颈总动脉到达主动脉，调节压力泵以6～8ATM扩张球囊，放松丝线，恢复血液供应，重复来回缓慢抽动球囊3次后，撤出球囊，靠近颈总动脉分叉处结扎颈外动脉近端，抽去颈总动脉处丝线，恢复动脉血流，同时查看颈总动脉及颈内动脉是否充盈搏动良好。各组大鼠均用碘伏清洗组织，再用生理盐水冲洗3遍，逐层缝合。术后 3 d预防性应用青霉素 20万U皮下注射，低分子肝素钙继续抗凝 3 d。术后普通饲料饮食，自由饮水1 w。术后第2周，除假手术组仍给普通饲料外，其余各组均予以高脂饲料喂养。高脂饮食饲喂6 w后开始采用相应药物灌胃。中药低剂量组、中药高剂量组分别予以痰瘀同治中药参红通络方生药量7.15 g/(kg·d)、28.60 g/(kg·d)灌胃；辛伐他汀组以辛伐他汀1 mg/(kg·d) 灌胃；假手术组、AS模型组予以等容积的生理盐水灌胃，1次/d，连续8 w。观察指标与测定方法：①一般状态观察：包括动物精神状态、毛色、饮食量、尿量、体重、死亡等情况。②血清样品制备：实验结束后，经眼球摘除取血，所取血液室温放置30 min至2 h，待其血清析出后，离心制备血清，-20℃冰箱贮存待测。③标本测定：酶法测定血清中TC、TG的含量，选择性沉淀法检测LDL-C，HDL-C的含量，ELISA法测定血清中sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β的含量。取大鼠主动脉常规石蜡包埋，切片后做苏木素-伊红(HE)染色，在光镜下观察组织形态学变化。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1一般情况 各组大鼠体重均明显增加，其中以模型对照组最为明显。假手术组、中药高剂量组大鼠性情较温顺，精神状态好，毛色光泽，体态匀称，进食水及排尿便正常。模型对照组、中药低剂量组、辛伐他汀组大鼠性情较暴躁，易撕咬，体态肥胖，多数大鼠精神不同程度萎靡，运动有所减少，皮毛蓬松而无光泽，其中又以模型对照组更为突出，排便相当。

2.2对AS大鼠血脂的影响 与假手术组比较，模型对照组血清TC、TG、LDL-C含量显著升高(P<0.01)，HDL-C含量显著降低(P<0.05)。与模型对照组比较，中药高剂量组、中药低剂量组与辛伐他汀组TC、TG、LDL-C含量均显著下降(P<0.05，P<0.01)，中药高剂量组HDL-C含量显著升高(P<0.05)，中药高剂量组在降低TC、LDL-C，升高HDL-C方面与辛伐他汀组相当(P>0.05)，但在降低TG方面明显优于辛伐他汀组(P<0.05)，中药低剂量组在改善TC、LDL-C水平方面明显优于辛伐他汀组(P<0.05)。见表1。

表1 各组血脂水平比较

2.3对AS大鼠血清sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β的影响 与假手术组比较，模型对照组动物血清sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β含量均显著升高(均P<0.01)。与模型对照组比较，中药高剂量组、中药低剂量组与辛伐他汀组sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β含量均显著下降(P<0.05，P<0.01)，且中药高剂量组与辛伐他汀组相当(P>0.05)，中药低剂量组sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β含量均显著高于辛伐他汀组(P<0.05,P<0.01)。见表2。

2.4主动脉病理情况 假手术组内膜光滑，平滑肌细胞排列整齐，模型对照组大鼠内膜欠光滑，平滑肌排列紊乱、增生，伴有大量泡沫细胞的蓄积，而经过药物干预后，内膜相对光滑，平滑肌细胞排列相对规整，少量泡沫细胞的蓄积和平滑肌增生改善，其中，中药高剂量组及辛伐他汀组显著优于中药低剂量组。见图1。

表2 各组血清sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β水平比较

图1 各组主动脉病理观察(HE，×200)

3 讨 论

AS发病机制尚未完全阐明，但损伤-炎症反应学说目前被大多数学者所认可〔2〕，炎症已成为AS发生发展过程中的核心因素。易损斑块的形成即是一个损伤与抗损伤、炎症激活与机体防御的慢性炎症过程〔3〕，炎症反应贯穿于AS斑块形成、发展和破裂的全过程。研究表明，sCD40L可刺激血管内皮细胞、巨噬细胞及平滑肌细胞等产生如IL、ICAM、TNF等多种与AS斑块形成相关的炎症因子，从而加速斑块的形成，当其表达水平越高时，其斑块形成速度越快〔4〕，且与斑块的易损性密切相关，被认为是心血管疾病患者预后的独立预测因素〔5～7〕。

参红通络方由人参、红景天、丹参、水蛭、栝蒌、石菖蒲等药物组成，具有益气活血、豁痰通络作用。前期研究证实，痰瘀同治法对血脂异常患者血脂四项均有不同程度改善〔8〕，能降低颈动脉粥样斑块患者颈动脉内膜中层厚度(IMT)及斑块 Crouse 积分〔9〕，同时能提高不稳定型心绞痛疗效及降低血空腹胰岛素(FINS)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平〔10〕。通过主动脉病理观察显示，参红通络方能保护血管内膜、减少脂滴沉积和泡沫细胞形成，具有稳定斑块的作用。综上，说明该复方制剂有较好的降脂、抑制炎性因子、保护血管内膜的作用，可能是其抗AS、稳定易损斑块的部分机制。