槐耳清膏对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及其机制

鲁明骞 周东奎 高嫣 冯雪松 陆海燕 李薇 孔庆志 卢宏达 李莉娥

(1三峡大学第一临床医学院肿瘤防治中心 宜昌市中心人民医院肿瘤科，湖北 宜昌 443003；2武汉市中心医院 武汉市肿瘤研究所；3宜昌人福药业有限责任公司)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据估计2017年美国妇女中有25万例新发浸润性乳腺癌患者和4万乳腺癌死亡病例，其发病率和死亡率均占恶性肿瘤的第二位〔1〕。我国乳腺癌发病率和死亡率也呈逐年增加趋势，位居女性恶性肿瘤的第一位，而且具有年轻化趋向。乳腺癌的治疗目前已形成了以手术治疗为主，联合化疗、放疗、内分泌、靶向药物、免疫和中医中药等多种手段的综合治疗措施，但仍易出现复发和转移〔2，3〕。因此，寻找新的分子靶点和新的治疗药物，来进一步阐明乳腺癌的发病机制，对乳腺癌的诊治具有十分重要的意义。

miRNA是一类十分重要的转录后调控因子的非编码小分子RNA，其长度由20～25个核苷酸组成，参与并调控人类约30%的编码基因，具有高度的稳定性和组织细胞来源的特异性，能影响蛋白质的表达〔4〕。通过调控靶基因miRNA的降解或抑制其翻译后，细胞的发育、增殖、分化和凋亡等会受到一定影响〔5〕。目前研究已发现的miRNA多达2 000多种，参与多种恶性肿瘤的发生和发展〔6～8〕，在肿瘤诊断、治疗与预后中发挥重要作用。

前期研究我们发现槐耳清膏能抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和诱导其凋亡〔9〕。既往研究表明，miR-126在乳腺癌的进程中起着重要作用，但槐耳清膏作用于乳腺癌MCF-7细胞的具体机制目前还不十分清楚，本研究将槐耳清膏作用于乳腺癌MCF-7细胞后，探讨miR-126表达与乳腺癌细胞增殖的影响，进一步了解槐耳清膏治疗乳腺癌的分子作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞株 人乳腺癌MCF-7细胞购自美国Amercian Type Culture Collection(ATCC)。

1.2药物与主要试剂 槐耳清膏由江苏启东盖天力药业有限公司提供，将精确重量的槐耳清膏溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，制成浓度为100 mg/ml的槐耳清膏储备液，并过滤除菌，-20℃储存备用。RPMI1640培养液购自美国Gibco公司，10%胎牛血清购自美国Hyclone，RNA提取试剂盒、miR-126引物系列试剂盒及RT-PCR试剂盒购自德国Qiagen公司。

1.3细胞培养及分组 乳腺癌MCF-7细胞平铺于六孔板中，5% CO2，37℃培养24 h后，分别加入浓度为3、6、9 mg/ml槐耳清膏溶液，并加入相同体积PBS，5% CO2，37℃继续培养24 h，待提取RNA。取槐耳清膏储备液，加入RPMI1640培养液和DMEM培养基制成浓度分别为3、6、9 mg/ml的槐耳清膏作为实验组，取RPMI1640培养液为空白对照组，采用RT-PCR相对定量法来检测miR-126的相对表达量，噻唑蓝(MTT)法测定MCF-7细胞转染与未转染miR-126 inhibitor或control的值。

1.4RNA的提取 加入Trizol和0.2 ml三氯甲烷，室温放置5～10 min，4℃ 25 000 r/min离心10 min，上层水相加入等体积的异丙醇沉淀水相中的RNA，室温放置20 min，离心沉淀，加入1 ml现配的75%乙醇，离心5 min，弃上清，-70℃超低温冰箱保存。

1.5实时荧光定量PCR 采用实时荧光定量PCR中的2-△△Ct法，以对照组浓度为0 mg/ml的量作为内参，检测到的Ct值来计算miR-126的表达量，取出少量的RNA溶液用Tris-EDTA缓冲液稀释后，测定其在分光光度计为260 nm和280 nm处的吸光度值，来测定RNA溶液浓度。miR-126引物序列根据TaqMan miRNA逆转录试剂盒操作说明书进行(正义链：CTCGCCCACCTACAGCAT，反义链：GACTTGACCACCGAACCC)，共40个循环，以U6 RNA作为内参值，2-△△Ct作为相对定量计算公式。

1.6miR-126 inhibitor使槐耳清膏抑制乳腺癌MCF-7的增殖作用减弱 乳腺癌MCF-7细胞经转染miR-126 inhibitor(miR-126 inhibitor组)或者control(空白对照组)后，重铺96孔板，每孔加入乳腺癌MCF-7，5%CO2，37℃培养12 h，然后加入浓度6 mg/ml的槐耳清膏溶液(转染control+6 mg/ml槐耳清豪溶液为6 mg/ml组，转染miR-126 inhibitor+6 mg/ml槐耳清膏溶液为6 mg/ml+miR-126 inhibitor组)，5% CO2，37℃继续培养48 h。10 μl MTT试剂继续培养3 h，用酶标仪测定溶液OD490检测细胞的存活情况。

1.7统计学方法 采用SPSS18.0统计软件进行t检验及单因素方差分析。

2 结 果

2.1槐耳清膏影响miR-126的表达 当槐耳清膏浓度为3 mg/ml、6 mg/ml和9 mg/ml时，其值分别是对照组的1.44倍、2.56倍和2.88倍，各浓度组均能上调miR-126的表达，且6 mg/ml与9 mg/ml组miR-126表达显著高于0 mg/ml和3 mg/ml组。见表1。

2.2槐耳清膏影响Pre-miR-126的表达 槐耳清膏浓度为3 mg/ml、6 mg/ml和9 mg/ml分别是对照组的1.26倍、2.51倍和2.98倍，不同浓度组的槐耳清膏溶液均能上调Pre-miR-126的表达，且6 mg/ml与9 mg/ml组Pre-miR-126表达显著高于0 mg/ml组和3 mg/ml组。见表1。

表1 各组miR-126、Pre-miR-126表达比较

2.3抑制miR-126使槐耳清膏对乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用减弱 与空白对照组比较，6 mg/ml组细胞抑制作用明显降低(1.00±0.00 vs 0.04±0.01；P<0.05)；与miR-126 inhibitor组比较，6 mg/ml+miR-126 inhibitor组细胞虽受到抑制作用，但抑制作用不强(1.19±0.23 vs 0.90±0.12;P>0.05)。

3 讨 论

乳腺癌的发生是多因素、多步骤的过程，miRNA及其靶基因在细胞的生长过程中保持着相对较稳定水平，从而维持着机体的正常生理功能〔10〕，体内的这种相对平衡关系一旦被打破，可能是导致乳腺癌发生的分子机制之一。研究证实miRNA在肿瘤发生发展过程中参与了多种信号的调控，临床已将miRNA表达的异常差异与恶性肿瘤的关系进行了相关研究，发现与肿瘤的发生发展、疗效和预后等密切相关〔11〕，它可以通过调控下游信号的传导通路从而影响肿瘤的增殖、侵袭与转移〔12,13〕。研究发现miR-126、miR-199等多个miRNA与乳腺癌中的表达及临床具有十分重要的意义〔14,15〕，参与乳腺癌的发生、发展、侵袭和迁移〔16〕。体外实验研究发现miR-126除能影响原发肿瘤的大小外，对肿瘤细胞增殖和转移灶的形成也有一定作用〔17〕。王承正等〔18〕采用RT-PCR 检测20例乳腺癌组织和癌旁组织中miR-126的表达，进一步研究发现乳腺癌组织中miR-126 表达明显低于癌旁正常组织中miR-126的表达(P<0.05)，miR-126的高表达明显抑制了MCF-7和MDA-MB-231细胞株的侵袭性(P<0.05)。

本研究结果显示，不同浓度的槐耳清膏溶液对miR-126及Pre-miR-126的表达具有上调作用，随着槐耳清膏药物浓度的增加，miR-126的表达越来越明显。既往的实验研究证明miR-126在乳腺癌中是抑制基因，能抑制肿瘤细胞的生长〔19〕，与本研究结果一致。乳腺癌患者中miR-126低表达与高表达的患者进行比较，总无转移生存期更短，故miR-126表达缺失可能与无复发生存具有相关性〔20〕。

本实验研究结果表明，miR-126作为乳腺癌的一种抑癌基因，对乳腺癌细胞的生长具有抑制作用，槐耳清膏可能通过上调miR-126的表达，达到抑制乳腺癌的增殖作用。miR-126作为人体内一种十分重要的抑癌基因，其表达量的变化与乳腺癌细胞增殖和凋亡密切相关。米旭光等〔21〕研究发现转染 miR-126 模拟物使乳腺癌细胞中miR-126 表达上调，增强肿瘤微血管形成相关的 VEGF 基因表达进一步降低，从而发挥着抑制乳腺癌的发展，降低乳腺癌转移的可能。Wang等〔22〕研究认为miR-126 作为乳腺癌转移的抑制因子之一，miR-126表达的缺失是导致乳腺癌复发和预后不良的一种重要因素，其机制可能是通过抑制乳腺癌细胞的细胞周期进程有关。

综上所述，槐耳清膏能抑制miR-126及Pre-miR-126的表达，从而抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖，这为槐耳清膏的抗肿瘤作用提供了新的分子机制。