开封市某场鸡源大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析

史秀玲

（河南省饲草饲料站，河南 郑州 450008）

近年来，（埃希氏）大肠杆菌的耐药性一直在逐渐上升，且已经在全世界范围内引起重视。大肠杆菌是一类需氧或微厌氧、革兰氏染色呈阴性、中等大小的杆状菌，在伊红美蓝琼脂培养基上会形成黑色金属光泽的菌落（菌落明显）。大肠杆菌是一种条件性病原菌（在正常情况下，不会引起机体发病，在机体的抵抗力变弱时，此微生物会大量地繁殖和改变寄生的部位，进而导致机体发病），常寄生在人和动物的肠道内，是一类人畜共患病原菌，其大多数是肠道内的正常菌群，只有少部分是引起病症的致病性菌群。

大肠杆菌病是一种细菌性疾病，大肠杆菌是目前使养殖业受危害最大的致病菌之一。近些年来，由于养殖户们对抗菌药物不合理的使用和滥用，使得鸡体内的大肠杆菌耐药菌株呈现递增的趋势，这将会危害我们的公共卫生环境，这种普遍存在的大肠杆菌的耐药性问题与使用抗菌药物的选择压力有关。

耐药性的大肠杆菌有两种：一种是天然存在的耐药菌，另一种是获得性耐药菌。获得性耐药菌的稳定性及耐药的种类，因不同的区域及用药的使用情况的不同而异，并且其耐药性可以遗传给下一代。当极少量的耐药性菌株存在于大量的敏感性菌株中，其危害并不严重，但如果在生产过程中频繁使用抗菌药物，敏感菌的生长将受到抑制，而耐药菌株继续生长繁殖，并最终形成耐药菌体系。

该研究对开封的某规模化养鸡场抽取样品进行大肠杆菌分离、鉴定，随后进行耐药性试验，对此场鸡源大肠杆菌的耐药情况有了初步认识，为进一步防控鸡源大肠杆菌病提供了临床试验资料和理论依据，同时也为在临床上指导养殖户合理用药提供了参考。该次耐药性测定选用的抗生素涉及10 类16 种，分别是青霉素类（氨苄西林、复方阿莫西林）、头孢菌素类（头孢噻呋、头孢他啶）、氨基糖苷类（庆大霉素、大观霉素）、四环素类（四环素、多西环素）、酰胺醇类（氟苯尼考）、磺胺类（磺胺异恶唑、复方新诺明）、氟喹诺酮类（恩诺沙星、氧氟沙星）、碳青霉烯类（美罗培南）、喹噁啉类（乙酰甲喹）、多粘菌素类（粘杆菌素）。其中乙酰甲喹无折点值，耐药率不判定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源 2018 年3 月抽取开封某鸡场肛门拭子样品40个。

1.1.2 标准菌株 大肠埃希氏菌（大肠杆菌）标准菌株ATCC 25922 购自中国兽医药品监察所。

1.1.3 使用培养基与试剂 革兰氏阴性细菌鉴定板（购自BD 公司）；一次性无菌采样棒（BPW）（购自郑州君越科莱特健康科技有限公司）；伊红美蓝琼脂和营养琼脂（购自北京路桥技术有限公司）。

1.1.4 仪器设备 细菌浊度仪，购自北京中西远大科技公司；全自动细菌鉴定/药敏系统（BD PhoenixTM-100），购自BD 公司；低温可叠放摇床（Thermo MaxQ600），购自Thermo公司。

1.2 试验方法

1.2.1 采集菌的处理 将一次性无菌采样棒（预增菌）采集的样品尽快送到实验室，进行36℃±1℃培养16～20 h，设阳性和阴性对照。

1.2.2 样品的分离纯化及鉴定 选取预增菌液1～2环，划线于伊红美兰琼脂上，36℃±1℃培养16～20 h，选取单个菌落（黑色金属光泽明显且典型）进行划线纯化培养，最后将纯化过的菌落接种于普通的营养琼脂培养基上，同样条件下进行培养，最后采用全自动细菌鉴定/药敏系统进行鉴定。

1.2.3 药敏试验 选取经过BD鉴定为大肠希埃氏菌的营养琼脂上的菌落，用生理盐水调到0.5 MCF，吸取10 μl加入肉汤中混匀，然后分别取100 μl 加入96 孔药敏板中，36℃±1℃培养16～20 h，最后读取药敏试验结果。

2 结果与分析

2.1 菌株分离结果

经过预增菌，大肠埃希氏菌的选择性培养基的分离纯化，以在伊红美蓝培养基呈黑金属光泽的为初筛的大肠杆菌，最后经全自动细菌鉴定/药敏系统鉴定（BD 鉴定仪），开封此规模化鸡场共分离大肠埃希氏菌25 株，总体分离率为62.50%（25/40）。

2.2 药敏试验结果

分离的25 株大肠杆菌，对四环素、氨苄西林、磺胺异恶唑、恩诺沙星、复方新诺明、氧氟沙星的耐药率较高，分别为84.00%、84.00%、100.00%、84.00%、88.00%、88.00%；对强力霉素（多西环素）、大观霉素、氟苯尼考、头孢噻呋中度耐药，耐药率在40.00%～80.00%之间；对多黏菌素E、头孢他啶、美罗培南较为敏感，耐药率均在20.00%以下。具体结果见表1、图1。

2.3 多重耐药结果

总体来说，分离得到的25株鸡源大肠杆菌的多重耐药严重，多重耐药率高达92.00%，主要集中在5耐和7耐，占64.00%，其中7 耐最多，占40.00%。分离到的25 株菌株，对抗生素的耐药情况结果见图2。

3 讨论

该试验从开封某鸡场抽取40 个样品，分离鸡源大肠杆菌25 株，分离菌株的耐药性结果比方杰等对青岛地区鸡源大肠杆菌耐药性检测中的氨苄西林（80.90%）要高；比艾伟昌等对河南省鸡源大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析研究中郑州地区的恩诺沙星（63.30%）和氨苄西林（73.30%）要高；比曲志娜等研究不同省区鸡源大肠杆菌耐药性调查中河南地区的庆大霉素（1.00%）、大观霉素（44.00%）、氨苄西林（46.00%）、四环素（42.00%）、恩诺沙星（80.00%）和复方阿莫西林（14.00%）要高。且多重耐药率已高达92.00%。由此来看，开封此场鸡源大肠杆菌的耐药现象较为严重。

在我国养殖业的逐步发展中，抗生素的滥用和无限制使用，使得鸡场的大肠杆菌的发病率不断增加，死亡率也是居高不下，大肠杆菌感染已经成为目前鸡的细菌性感染的疾病之首。研究表明，不同菌株对抗菌药物的敏感性存在差异，在使用抗菌药物治疗时，需加强对病原菌耐药性的检测，并对病原菌进行药敏试验，筛选出使病原菌敏感的抗菌药物，实现在临床上的合理规范用药，有效减缓细菌耐药性的产生。在生产过程中着手搞好卫生环境；加大对所用器具及禽舍的消毒频率；注意育雏期的饲养密度及保温处理；饲料应无粪便污染；营养要合理与全面，从而降低菌种的耐药性。目前，世界上就针对动物源性大肠杆菌对人用抗菌药物耐药性研究的报道寥寥无几，这可能是治疗动物源性大肠杆菌病的一个突破口。□

表1 分离的25株菌对16种抗生素的具体耐药情况

图1 25株鸡源大肠杆菌的耐药结果

图2 25株鸡源大肠杆菌的多重耐药结果