中药水煎液中乳酸菌发酵降低泡菜 亚硝酸盐含量的研究

◎ 葛瑶洁，韩 露，冯尚坤，段文凯，廖建伟

（台州科技职业学院农学院，浙江 台州 318000）

泡菜脆嫩芳香、口感独特，含丰富的营养物质，同时具有健胃理气、预防心脑血管疾病等功效，深受消费者喜爱。但腌制过程中，微生物产生的硝酸盐还原酶将蔬菜中硝酸盐还原为亚硝酸盐。后者在体内能将血红蛋白Fe2+氧化，使其变为高铁血红蛋白，携氧能力降低，易引起急性中毒，严重时可致死亡[1]。另外，亚硝酸盐会与胃中含氮化合物结合成有强致癌性的亚硝胺[2]。

截止目前，亚硝酸盐控制方法的研究重点在发酵方法的选择、辅料的添加和发酵过程条件控制上。如发酵方法方面，郝明玉、陈聪等[3-4]从传统腌制泡菜中筛选得到乳酸菌，比较了直投式和自然发酵方法的优劣。乳酸菌研究集中在筛选产酸和降解亚硝酸盐能力较强的菌株上[5]。发酵过程，调节盐的添加量、温度和发酵液的PH值来降低亚硝酸盐[6-8]。泡菜原辅料使用中，潮州菜惯用薄荷、罗勒和香菜调味，三者均有很好的亚硝酸盐的清除和亚硝胺合成的阻断能力[9]。另外随着茶多酚、谷胱甘肽、维生素C添加量的增加，泡菜与泡菜液中亚硝酸盐含量均逐渐减少[10-12]。

泡菜中添加中草药是近年出现的一种新方法，相关研究还处于初级阶段。如贾晶晶[13]等研究发现添加黄芩溶液会降低发酵白菜中亚硝酸盐含量。我国中草药资源丰富，使用历史悠久，本课题在复合中药水煎液中，采用人工接种结合自然发酵方法腌制泡菜，通过正交试验获得最优工艺，以期提高泡菜的安全、风味和保健功能，助力本国泡菜特色化，标准化，进而提高中式泡菜的国际地位。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豇豆、白菜、白萝卜、胡萝卜、黄瓜、蒜、生姜、白砂糖、食盐（无碘）：浙江省台州市市椒江欧尚超市；当归、党参、黄芪：岷县和泰中药材有限公司；乳酸菌：四川高福记生物科技有限公；亚硝酸盐：分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司；对氨基苯磺酸：分析纯，天津市化学试剂研究所；盐酸萘乙二胺：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；亚铁氰化钾：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙酸锌：分析纯，永华化学科技（江苏）有限公司；乙酸：分析纯，杭州化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

722sp可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；FA1004C电子天平，上海越平科学仪器（苏州）制造有限公司；PYX-DH450B-S电热恒温培养箱，上海天恒医疗器械有限公司；HH2恒温水浴锅，邦西仪器科技（上海）有限公司；800 mL自动排气发酵罐，淄博治德轻工制品有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 泡菜试验技术方法

泡菜试验技术路线图见图1。

图1 泡菜试验技术路线图

1.3.2 复合中药水煎液的制备

称取不同质量（90 g、180 g、270 g、360 g和 450 g）的复合中药材（切片后的当归，党参，黄芪质量比为5∶3∶2）于3 000 mL烧杯中，加水浸泡 0.5 h，烧杯盖上玻璃皿盖，前后分3次共煎120 min，分别为50 min、40 min和30 min。每次煎之前加水，水量为中药重量的5倍。单次煎煮结束趁热过滤，最后合并3次过滤液加热浓缩至450 mL，于121 ℃下高压灭菌20 min。

1.3.3 发酵过程中不同蔬菜亚硝酸盐含量的比较

蔬菜分别选择豇豆、白菜、白萝卜、胡萝卜、黄瓜去杂清洗干净，切分后，晾干（所有接触蔬菜的刀具、案板等都提前清洗干净，保证无油）。同时泡菜罐清洗后（无油）晾干。称取晾干的蔬菜各225 g，分别置于泡菜罐中。用凉白开配制盐3%、糖2%的盐水溶液，分别倒入泡菜罐，各泡菜添加4.5 g蒜和生姜，泡菜罐做好标记，30 ℃密封腌制。每24 h检测其中的亚硝酸盐含量。

1.3.4 乳酸菌接种量对泡菜中亚硝酸盐含量的影响

将新鲜的白菜清洗干净，剥除坏叶，切去根部，切成2 cm×2 cm见方的块状，称取晾干的蔬菜225 g， 生姜、大蒜各4.5 g，白砂糖9 g，置于发酵罐中。发酵罐中发酵条件：倒入0.6 g·mL-1复合中药水煎液 450 mL，食盐5%。泡菜罐上做好标记，密封于30 ℃腌制。各罐乳酸菌添加量依次是：0.1‰、0.2‰、0.3‰、0.4‰和0.5‰。

1.3.5 食盐浓度对泡菜中亚硝酸盐含量的影响

蔬菜和辅料质量及处理技术见1.3.4，发酵罐中发酵条件：倒入0.6 g·mL-1复合中药水煎液450 mL，添加0.2‰乳酸菌。泡菜罐上做好标记，密封于30 ℃腌制。各罐的食盐浓度依次为：1%、3%、5%、7%和9%。

1.3.6 中药复合水煎液浓度对泡菜中亚硝酸盐含量的影响

蔬菜和辅料质量及处理技术见1.3.4，发酵罐中发酵条件：倒入复合中药水煎液450 mL，食盐5%、乳酸菌0.2‰。泡菜罐上做好标记，密封于25 ℃腌制。各罐中药复合水煎液浓度依次为：0.2 g·mL-1、 0.4 g·mL-1、0.6 g·mL-1、0.8 g·mL-1和1.0 g·mL-1。

1.3.7 发酵温度对泡菜中亚硝酸盐含量的影响

蔬菜和辅料质量及处理技术见1.3.4，发酵罐中发酵条件：倒入0.6 g·mL-1复合中药水煎液450 mL，添加0.2‰乳酸菌、5%食盐。各泡菜罐上做好标记，分别密封于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃腌制。

1.3.8 泡菜中亚硝酸盐含量的测定

亚硝酸盐含量的检测参见国家标准GB 5009.33—2016 第二法——分光光度法。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中不同蔬菜亚硝酸盐含量的比较结果

由图2知，在自然发酵情况下，不同蔬菜均在第2 d达到亚硝酸盐峰值，之后亚硝酸盐含量慢慢下降至国家限量以下。其中尤以白菜的亚硝酸盐含量为高，其峰值达到249.56 mg·kg-1，其他蔬菜亚硝酸盐峰值均低于100 mg·kg-1，且同一时间，泡菜中亚硝酸盐含量均低于白菜。为了便于观察亚硝酸盐含量的变化，选择白菜进行后续试验。

图2 不同蔬菜发酵过程中亚硝酸盐含量的变化图

2.2 各因素对亚硝酸盐峰值与终值的影响

2.2.1 乳酸菌接种量对泡菜中亚硝酸盐含量的影响

目前已有商业化的固体泡菜乳酸菌发酵剂，方便直投式发酵泡菜或者人工接种结合自然发酵。直投式发酵亚硝酸盐含量远低于自然发酵，但是前者需要预先对蔬菜原料进行灭菌处理，对实验材料风味有一定影响，且增加成本。董静等[6]比较了人工接种结合自然发酵与纯自然发酵的优劣，发现人工接种乳酸菌结合自然发酵，不仅不破坏蔬菜本身风味，而且相比自然发酵，亚硝酸盐峰值低，降低速度快，含量少。因此，本实验采用人工接种结合自然发酵的方法。

由图3知，白菜本身含有一定量的亚硝酸盐，随着发酵时间的延长，不同乳酸菌添加量下，亚硝酸盐含量逐渐增加，且均在24 h到达亚硝酸盐峰值。之后，亚硝酸盐含量迅速降低，在72 h候后变化平缓。乳酸菌添加量越高，亚硝酸盐的峰值越低，添加量为0.1‰时，峰值达到113.7 mg·kg-1，添加量增加到0.2‰时，峰值迅速降至26.4 mg·kg-1。同时随着添加量的增加，6 d后的亚硝酸盐含量逐渐减少。添加量为0.5‰时，尽管亚硝酸盐终值非常低，但是乳酸菌添加量偏大，泡菜口感过酸。经综合考虑选择0.2‰、0.3‰和0.4‰做后续的正交试验。

2.2.2 食盐浓度对泡菜中亚硝酸盐含量的影响

在泡菜腌制初期，乳酸未大量生成，对各类杂菌的抑制作用比较弱，主要依靠食盐来抑菌。由图4知，不同食盐浓度，各个泡菜的出峰时间差异比较大。1%和3%浓度是在24 h出峰，5%浓度72 h出峰，7%和9%浓度96 h出峰。这是因为食盐浓度越高，杂菌受到的抑制作用越强，因此，亚硝酸盐出峰时间较晚，但是同时也会一定程度上抑制乳酸菌的生长繁殖，导致峰值较高。因此可以看到6 d以后亚硝酸盐含量随着浓度的升高而增大。考虑到7%和9%浓度的泡菜亚硝酸盐含量均偏高，同时口感上过咸不利健康，取1%、3%、5%做进一步的正交试验。

图3 不同乳酸菌添加量对泡菜中亚硝酸盐含量的影响图

图4 食盐浓度对泡菜中亚硝酸盐含量的影响图

2.2.3 中药复合水煎液浓度对泡菜中亚硝酸盐含量的影响

中药黄芪、当归、党参具有补气益血的效用，同时经研究证实，能抑制泡菜中有害杂菌的生长又对有益乳酸菌起到一定的促进作用[14]。由图5知，黄芪、当归、党参的复合中药水煎液0.2 g·mL-1和0.4 g·mL-1浓度48 h出峰，0.6 g·mL-1、0.8 g·mL-1以及1.0 g·mL-1均在24 h出峰。亚硝酸盐峰值随中药浓度的增加而整体下降，但是1.0 g·mL-1浓度峰值却较0.8 g·mL浓度的 高，这可能是因为高浓度的中药水煎液不利于乳酸菌的生长。取出峰时间相对较前，峰值较低的0.6 g·mL-1、 0.8 g·mL-1、1.0 g·mL-1做进一步的正交试验。

2.2.4 不同发酵温度对硝酸盐含量的影响

由图6知，温度对亚硝酸盐出峰时间及峰值均有较大影响。发酵温度为20 ℃和25 ℃时，均在第3 d出峰，而30 ℃、35 ℃和40 ℃均在24 h即出峰，即温度越高，出峰时间越早。同时总体来看40 ℃以下，温度越高，峰值越小，第6 d终值也越小。温度从35 ℃变为40 ℃，峰值不降低反而增大，这可能是因为温度较高以后，开始部分抑制了乳酸菌的生长繁殖，导致其他杂菌生长繁殖加快，硝酸盐较多被还原为亚硝酸盐。

图5 不同浓度中药复合水煎液对亚硝酸盐含量的影响图

图6 不同发酵温度下泡菜中亚硝酸盐含量的变化图

在温度的研究上存在一些争议，徐海菊等[15]发现高温比低温的亚硝酸盐峰值低，亚硝酸盐峰提前，这与本研究一致，但是周强[16]等人研究结果则显示，温度高，亚硝酸盐含量高，出峰时间不变。这可能是原辅材料种类、微生物本底数、体系pH以及发酵过程中微生物的繁殖速度的影响所致。综合考虑到峰值、终值以及能耗，选择25 ℃、30 ℃和35 ℃作为后续正交试验水平。

2.2.5 白菜泡菜最佳工艺条件优化

根据各个单因素的实验结果，每个因素取三水平进行正交实验，因素水平见表1。以正交设计表安排实验，以6 d后的亚硝酸盐含量为指标。由表2知，极差A＞B＞D＞C，即影响亚硝酸盐含量的顺序依次是乳酸菌添加量、食盐浓度、温度、中药复合水煎液浓度。极差分析结果显示，以6 d后亚硝酸盐含量为指标，最佳制备工艺条件为A2B2C1D2。即当乳酸菌添加量0.3‰，食盐浓度为3%，复合中药水煎液浓度为0.6 g·mL-1，温度为30 ℃时，亚硝酸盐含量最低。按照这一最佳条件进行验证试验，6 d后亚硝酸盐含量为0.713 mg·kg-1。从本课题研究来看，通过调整乳酸菌添加量、食盐浓度、发酵温度和复合中药水煎液浓度可有效消减泡菜中亚硝酸盐，且短期内就可以降至远低于国家安全标准上限的范围。

表1 L9（34）优化白菜泡菜工艺的因素水平表

表2 正交实验结果表

3 结论

结果表明，各个因素对亚硝酸盐含量的影响大小依次是乳酸菌添加量＞食盐浓度＞温度＞中药复合水煎液浓度。当乳酸菌添加量0.3‰、食盐浓度3%，复合中药水煎液浓度为0.6 g·mL-1、温度30 ℃时，6 d后亚硝酸盐含量最低。在这样的条件下，泡菜安全性最高，同时口感爽脆，营养丰富。