肝细胞癌患者射频消融术后血清长链非编码RNA LINC00205 表达量及临床意义

彭孝春， 陆 霜， 柳 扬， 顾福嘉

肝癌是临床常见的恶性肿瘤，据报道全世界每年约有75 万新发病例［1］。根治性切除术为治疗肝癌的首选方法，但肝癌起病隐匿，早期较难觉察，多数患者确诊时已为中晚期，因此丧失根治性切除治疗的机会［2-3］。 而部分肝癌患者对化疗药物不耐受，导致治疗中断［4-5］，因此急需寻找安全便捷、疗效确切的方法用于肝癌患者的治疗。 射频消融术（radiofrequency ablation，RFA）因具有安全、创伤小、操作简单、术后并发症少的优点，在肝癌的治疗中得到广泛认可［6-7］。 RFA 能改善肝癌患者生活质量，提高患者生存率，然而术后肿瘤复发对患者的长期生存造成严重影响，预后情况仍不乐观［8］。及早预测肝癌患者预后对制定有效措施改善患者预后具有重要意义。 但目前临床尚无用于预测肝癌患者预后的准确、灵敏的标记物。 因此临床亟需探寻准确、敏感的生物学标记物评估肝癌患者预后。 长非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度超过200 个核苷酸的新型非编码RNA［9］，已有研究证实多种lncRNA 参与肿瘤的发生、发展过程［10-11］。Cui等［12］通过测序及微阵列技术发现长链非编码RNA LINC00205（long non-coding RNA LINC00205，LncRNA LINC00205）在肝癌组织中异常表达。 本研究冀为临床预测肝癌患者预后情况提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料

前瞻性选取2016 年1 月至2018 年9 月在贵州省人民医院接受治疗的135 例肝癌患者作为研究对象。 参照《原发性肝癌规范化诊治专家共识》［13］中关于肝癌诊断的内容对疑似肝癌患者进行诊断。纳入标准： ①经病理活检确诊为肝癌且为初次确诊；②美国东部肿瘤协作组（eastern cooperative oncology group，ECOG）活动状态评分＜1 分；③近期未接受化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗等抗肿瘤治疗；④巴塞罗那分期（Barcelona Clinic Liver Cancer）A 期；⑤病灶数目≤3 个；⑥肿瘤直径≤5 cm；⑦签署知情同意书。 排除标准：①合并其他部位肿瘤；②穿刺部位皮肤溃破；③妊娠期及哺乳期妇女；④严重心、肾、肺等功能不全者；⑤肝功能Child-Pugh C 级；⑥有严重出血倾向者；⑦大量腹腔积液；⑧肿瘤病灶邻近脉管或主要大血管；⑨随访失联者。 135 例肝癌患者男88 例，女47 例，年龄42～79 岁，平均（65.0±6.5）岁。根据患者是否复发将患者分为复发组（n=49）和未复发组（n=86）。 本研究获得本院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 RFA 治疗 患者于术前行血常规、肝肾功能及影像学检查。 术中密切监测心电图、血压、呼吸等生命体征。 患者在接受RFA 治疗前保持空腹4～6 h，全身静脉麻醉，采用超声确定病灶的位置、穿刺方向、角度及进针深度。2%利多卡因局麻，以实时超声透视下将Chiba 针为导引针刺入病灶， 将射频电极针沿导引针方向进入病灶。 根据病灶大小、位置设定消融参数：瘤体直径＜3 cm，温度90～110℃，时间20～30 min。 消融结束后退针并消融针道，术中超声造影复查消融结果，确定有无肿瘤残余及肝包膜下出血、气胸等症状。 消融过程中，实时动态观察，确认导引针和消融针位置及方向正确。

1.2.2 血清学指标检测 抽取肝癌患者RFA 术后12 h 空腹外周静脉血10 mL，室温下4 000 r/min 离心10 min，分离上层血清，置于-80℃冰箱，待测。 采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测肝癌患者血清LncRNA LINC00205 相对表达量。 Trizol 试剂提取的血清中的总RNA， 将2 μg 的总RNA 添加至20 μL 反应液中， 采用Tianscript RT 反转录试剂盒（北京天根生化科技有限公司）反向转录合成cDNA， 最后PCR 扩增。 反应条件为：94℃10 min，94℃45 s，60℃45 s，72℃45 s，40 个循环。LncRNA LINC00205 正 向：5'- CCCTGGAGTCGGTGCTAAA TAC-3'， 反向：5'-TAGACTAGTGAGGGGGGCA-3'。β- actin 正 向：5’- UAGCUUAUCAGACUGAUGUU GA-3’，反向：5’-GTCAGTCGCTTGGGCTGT-3’。以βactin 为内参， 采用2-ΔΔCt表示LncRNA LINC00205 相对表达量。

1.2.3 随访 采用复诊的方式对患者进行为期12个月的随访，了解患者复发情况，所有患者出院后均规律随访，每月检测甲胎蛋白、癌胚抗原、CA19-9等肿瘤标志物，术后6 个月每个月复查1 次，其后每3 个月复查1 次。 采用超声造影或增强CT 复查，如影像学检查在肝内发现新病灶则经病理活检确诊。 随访起始时间为2017 年1 月17 日，截止时间为2019 年9 月23 日，中位随访时间为9 个月。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据处理。 服从正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验。 计数资料用例或率［n（%）］表示，采用卡方检验。 用受试者工作特征（ROC）曲线分析LncRNA LINC00205 评估肝癌患者预后的价值。 采用Kaplan-Meier 及Cox 单因素及多因素回归分析影响肝癌患者预后的相关因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料比较

135 例肝癌患者随访期间复发49 例（36.3%）。两组在年龄、性别、体质量指数、HbsAg、ASA 分级、病灶位置方面比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；在肿瘤直径、分化程度，血清AFP、白蛋白、总胆红素方面比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表1。

2.2 血清LncRNA LINC00205 评估肝癌患者预后的效能

复发组患者血清LncRNA LINC00205 相对表达量为（3.52±0.81），高于未复发组（3.19±0.78），差异有统计学意义（t=2.331，P=0.021）。 血清LncRNA LINC00205 评估肝癌患者复发的受试者工作特征（ROC）曲线的曲线下面积（AUC）、灵敏度、特异度、最佳截断点分别为0.825（95%CI：0.750～0.885）、83.67%、55.28%、3.04。 见图1。

2.3 血清LncRNA LINC00205 与肝癌患者预后的关系

根据血清LncRNA LINC00205 评估肝癌患者复发的最佳截断点（3.04）将患者分为高LncRNA LINC00205组（LncRNA LINC00205≥3.04，n=71）和低LncRNA LINC00205 组（LncRNA LINC00205＜3.04，n=64）。高LncRNA LINC00205 组复发率为52.11%（37/71），高于低LncRNA LINC00205 组的18.75%（12/64），差异有统计学意义（χ2=4.986，P=0.026）。 高LncRNA LINC00205 组患者中位生存时间为11 个月，低于低LncRNA LINC00205 组的12 个月，差异有统计学意义（Log Rank Chi-square=14.361，P＜0.001）。 见图2。

表1 两组基线资料比较 ±s，n（%）

表1 两组基线资料比较 ±s，n（%）

因素 复发组（n=49）未复发组（n=86） t/χ2 值 P 值年龄/岁 65.9±6.8 64.5±6.4 1.242 0.216性别/n（%） 0.532 0.466男30（61.2） 58（67.4）女19（38.8） 28（32.6）体质量指数（kg/m2） 22.83±3.18 23.35±3.26 0.899 0.370 HBsAg/n（%） 0.503 0.478阴性 11（22.5） 15（17.4）阳性 38（77.6） 71（82.6）肿瘤直径/n（%） 8.991 0.003≥3 cm 23（46.9） 19（22.1）＜3 cm 26（53.1） 67（77.9）AFP/n（%） 3.897 0.048≥400 μg/L 28（57.1） 34（39.5）＜400 μg/L 21（42.9） 52（60.5）ASA 分级/n（%） 0.859 0.354Ⅰ～Ⅱ 33（67.4） 51（59.3）Ⅲ14（32.7） 35（40.7）病灶位置/n（%） 0.348 0.555单侧 30（61.2） 57（66.3）双侧 19（38.8） 29（33.7）分化程度/n（%） 5.358 0.021高、中分化 15（30.6） 44（51.2）低分化 34（69.4） 42（48.8）白蛋白/（g/L） 43.62±4.74 36.08±4.21 9.555 ＜0.001总胆红素/（μmol/L） 41.73±4.52 34.83±4.15 8.992 ＜0.001

图1 血清LncRNA LINC00205 评估肝癌患者复发的ROC 曲线

2.4 影响肝癌患者预后的因素

将年龄、性别、体质量指数、HbsAg、肿瘤直径、AFP、ASA 分级、病灶位置、分化程度、白蛋白、总胆红素及LncRNA LINC00205 作为自变量，将肝癌患者预后情况作为因变量纳入Cox 单因素回归分析，结果显示肿瘤直径、 分化程及LncRNA LINC00205可能与肝癌患者复发存在联系。按纳入标准α≤0.10，将上述因素纳入Cox 多因素分析，结果显示分化程度及LncRNA LINC00205 与肝癌患者复发密切相关。（表2，表3）

图2 血清LncRNA LINC00205 与肝癌患者预后的关系

表2 赋值情况

表3 影响肝癌患者预后的因素

3 讨论

近年来，RFA 治疗在治疗肝癌方面取得一定的疗效，然而，由于肝癌具有血供丰富、浸润性生长的特点导致RFA 在治疗肝癌时可能发生癌细胞残留，影响患者预后情况［14-16］。 因此需探寻可用于肝癌患者预后评估的指标。目前，关于LncRNA LINC00205在肿瘤中的作用已有初步研究， 有证据表明，LncRNA LINC00205 在肝癌组织中异常表达［12］。 但关于LncRNA LINC00205 与肝癌患者预后的关系尚未可知，因此本研究就LncRNA LINC00205 与肝癌患者预后的关系进行探讨。

本研究通过对肝癌患者进行为期12 个月的随访，了解患者预后情况，结果发现135 例患者12 个月内复发率约为36.30%，与施显茂等［17］研究结果相近。 本课题同时比较不同预后患者血清LncRNA LINC00205 相对表达量， 结果提示检测血清LncRNA LINC00205 有助于评估肝癌患者复发情况。 由此构建了血清LncRNA LINC00205 评估肝癌患者复发的ROC 曲线，表明血清LncRNA LINC00205评估肝癌患者复发的效能较高；高LncRNA LINC00205组患者复发率高于低LncRNA LINC00205 组、中位生存时间低于低LncRNA LINC00205 组，表明血清LncRNA LINC00205 可能与肝癌患者复发相关。 肝癌复发情况受多种因素影响，采用Cox 单因素及多因素回归分析影响肝癌患者复发的因素，结果显示分化程度与肝癌患者复发密切相关， 结果与Murakami 等［18］研究相符。 此外，本研究结果显示LncRNA LINC00205 与肝癌患者复发密切相关。

基础研究表明，敲除LncRNA LINC00205 基因后，miR-122-5p 表达量明显升高， 两者呈竞争性抑制的关系［19］。 微RNA-122-5p（microRNA-122-5p，miR-122-5p）与肝癌的发生、发展关系密切［20］。miR-122-5p 主要在肝脏中表达，参与肝脏多个生理学过程，如应激反应和脂质代谢过程［21-22］。 miR-122-5p可通过调节SRF 蛋白介导的上皮-间充质转化过程抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭［23］。 此外，miR-122-5p 的过表达可降低B 细胞淋巴因子-w 和细胞周期蛋白cyclin G1 的表达，进而触发癌细胞的细胞周期停滞并导致癌细胞凋亡［24］。 因此笔者推测LncRNA LINC00205 可能通过调节miR-122-5p 的表达参与肝癌的疾病进程。

本研究存在一定不足，仅测定了一个时间点的LncRNA LINC00205 表达情况，且未进行基础研究。下一步将动态监测LncRNA LINC00205 表达情况并进行基础研究，分析LncRNA LINC00205 影响肝癌患者预后的病理生理机制。

综上所述，检测血清LncRNA LINC00205 表达情况有助于评估肝癌患者预后情况。