HPLC多指标成分定量与化学计量学相结合的搜风理肺丸质量评价

冯婉红，马灵珍（.浙江中医药大学滨江学院附属江南医院药学部，浙江 杭州 30；.亳州职业技术学院药学院，安徽 亳州 36800）

搜风理肺丸是由桔梗、荆芥穗、黄芩等14味中药材组方而成，临床上主要用于外感风寒、肺失宣降所致发热恶寒、头痛无汗、四肢酸软、鼻塞流涕、咳嗽痰多、胸闷喘息等病症的治疗[1]。中药复方制剂具有多组分、多靶点、多通道等特点，所含成分相互协同制约，对机体生物分子网络进行广泛调节，以达到临床治疗效果。搜风理肺丸现行质量控制标准[1]和文献报道[2]仅对当中黄芩苷进行定量分析，未建立多指标成分质量控制方法，难以全面反映该制剂的整体产品质量，直接影响临床疗效的稳定性和一致性。多成分质量控制模式能全面反映中成药复方制剂的整体内在质量，有助于药品生产企业和监管部门不断提升该制剂的质量控制标准，完善药材来源和制剂生产过程控制，以达到产品质量的稳定性。本文以君臣佐使中医配伍理论为依据，参考中药质量标志物的确认原则，采用HPLC法同时测定搜风理肺丸中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黄芩苷、汉黄芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素的含量，并采用聚类分析、主成分分析等化学计量学方法对测定结果进行分析评价，为该制剂质量控制标准的提升提供参考依据。

1 仪器与试药

对照品黄芩苷、汉黄芩苷、白花前胡甲素和白花前胡乙素来源于中国食品药品检定研究院，批号分别为110715-201821、112002-201702、111711-201904和111904-201804，质量分数分别为95.4%、98.5%、99.4%和98.9%。对照品去芹糖桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3来源于成都普思生物科技股份有限公司，批号分别为PS010234和PS010235，质量分数分别为98.8%和98.9%。对照品桔梗皂苷E和白花前胡E素来源于上海同田生物技术股份有限公司，批号分别为18030721和18031222，质量分数分别为98.5%和99.9%。搜风理肺丸（规格：9 g）分别来源于北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂（批号分别为20013006、20013008、20013012、20013015、20013018、20013019和20013021，编号依次为S1～ S7）和桂林三金药业股份有限公司（批号分别为191007、191109和200302，编号依次为S8 ～ S10）。乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯。Waters 2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；BS110S型电子分析天平（德国Sartorius公司）；KQ-3200V型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液 分别取去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黄芩苷、汉黄芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E素对照品适量，精密称定，用60%甲醇制成浓度分别为0.128、0.194、0.106、3.854、0.698、0.622、0.156和0.272 mg·mL-1的混合对照品贮备液。精密吸取混合对照品贮备液1.0 mL，用60%甲醇稀释至20 mL，制成去芹糖桔梗皂苷E 6.4 μg·mL-1、桔梗皂苷E 9.7 μg·mL-1、桔梗皂苷D35.3 μg·mL-1、黄芩苷192.7 μg·mL-1、汉黄芩苷34.9 μg·mL-1、白花前胡甲素31.1 μg·mL-1、白花前胡乙素7.8 μg·mL-1、白花前胡E素13.6 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 取适量搜风理肺丸，剪碎后取2.0 g，精密称定，加入60%甲醇20 mL，对样品进行30 min的超声处理，放冷后用60%甲醇稀释至25 mL，混合均匀，过滤，制得搜风理肺丸供试品溶液。取适量按搜风理肺丸质量标准项下处方比例和制法制得的缺桔梗、缺黄芩和缺前胡的阴性供试品，按上述方法制成阴性供试品溶液。

2.2 色谱条件与专属性实验

以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速0.9 mL·min-1；采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长分别为210 nm（0 ～ 23 min检测去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3）[3-4]、280 nm（24 ～ 34 min检测黄芩苷和汉黄芩苷）[5-7]和321 nm（35 ～ 60 min检测白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素）[8-9]。理论塔板数按各成分色谱峰计应≥ 4000。精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液及“2.1.2”项下供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪中，记录所检测色谱图（图1）。结果显示，混合对照品和搜风理肺丸供试品色谱图中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黄芩苷、汉黄芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素与相邻色谱峰均能良好分离（分离度均＞1.5）；色谱峰峰形对称，拖尾因子符合规定要求；阴性供试品对搜风理肺丸中上述成分的同时测定无干扰。

图1 HPLC色谱图A - 混合对照品，B - 搜风理肺丸供试品，C - 桔梗阴性供试品，D -黄芩阴性供试品，E - 前胡阴性供试品；1 - 去芹糖桔梗皂苷E，2 -桔梗皂苷E，3 - 桔梗皂苷D3，4 - 黄芩苷，5 - 汉黄芩苷，6 - 白花前胡甲素，7 - 白花前胡乙素，8 - 白花前胡E素Fig 1 HPLC chromatogramA - mixed reference, B - Soufeng Lifei pills sample, C - negative sample without platycodonis radix, D - negative sample without scutellaria radix, E - negative sample without peucedanum radix; 1 -deapi-platycoside E, 2 - platycoside E, 3 - platycodin D3, 4 - baicalin,5 - wogonoside, 6 - praeruptorin A, 7 - praeruptorin B, 8 - praeruptorin E

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系 精密吸取“2.1.1”项下贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、2.5 mL，分别用60%甲醇稀释至20 mL，制得系列质量浓度溶液，各取10 μL进样，测定去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黄芩苷、汉黄芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素的峰面积，以峰面积为Y轴，质量浓度（μg·mL-1）为X轴进行回归，得回归方程和线性范围，见表1。

表1 搜风理肺丸中8种成分的回归方程、r和线性范围Tab 1 Regressive equations、correlation coefficients and linear ranges of eight components in Soufeng Lifei pills

2.3.2 精密度 取同一份搜风理肺丸（编号：S1）供试品溶液进样10 μL，测定8种成分的峰面积，测得各成分峰面积的RSD分别为1.20%、1.07%、1.42%、0.55%、0.71%、0.68%、0.81%、1.05%。

2.3.3 重复性 取同一批次搜风理肺丸（编号：S1），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，重复操作6次，各取10 μL进样测定8种成分的峰面积，计算得各成分含量的RSD分别为1.76%、1.69%、1.87%、0.96%、1.25%、1.32%、1.61%、1.79%。

2.3.4 稳定性 取一份搜风理肺丸（编号：S1）供试品溶液，于0、2、4、8、16、24 h各进样10 μL，检测8种成分的峰面积，结果显示搜风理肺丸供试品溶液24 h稳定，各成分峰面积的RSD分别为1.13%、1.22%、1.39%、0.60%、0.88%、0.75%、0.89%、1.12%。

2.3.5 加样回收率 取已知去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黄芩苷、汉黄芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E素含量的搜风理肺丸（编号：S1）9份，每份1.0 g，精密称定，随机平分成3组，精密加入混合对照品溶液（去芹糖桔梗皂苷E 0.086 mg·mL-1、桔梗皂苷E 0.138 mg·mL-1、桔梗皂苷D30.054 mg·mL-1、黄芩苷2.852 mg·mL-1、汉黄芩苷0.496 mg·mL-1、白花前胡甲素0.432 mg·mL-1、白花前胡乙素0.118 mg·mL-1、白花前胡E素0.174 mg·mL-1）0.5、1.0、1.5 mL各一组，再按“2.1.2”项下方法制成加样供试品溶液。精密吸取上述9份溶液各10 μL，进样检测8种成分的峰面积，计算得8种成分平均加样回收率分别为98.70%、97.97%、96.95%、100.10%、99.22%、99.78%、97.73%、98.05%，RSD分别为1.41%、1.38%、0.97%、0.89%、1.00%、0.83%、1.26%、1.52%（n= 9）。

2.4 样品含量测定

取搜风理肺丸样品10批，每批次按照“2.1.2”项下方法制备搜风理肺丸供试品溶液3份，各进样10 μL检测去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黄芩苷、汉黄芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素的峰面积，计算得8种目标化合物的含量，见表2。

表2 搜风理肺丸中8种成分的含量测定结果. mg·g-1，n = 3Tab 2 The content results of eight components in Soufeng Lifei pills. mg·g-1, n = 3

2.5 化学计量学分析

2.5.1 聚类分析 将“2.4”项下10个批次搜风理肺丸中8种成分含量测定结果导入SPSS 26.0软件中，采用组间联接聚类方法，以欧氏距离为测度，对10个批次搜风理肺丸样品进行聚类分析。结果显示，当类间距离为15时，10批搜风理肺丸样品聚为2类，样品S4、S6、S5、S1、S7、S2和S3聚为第Ⅰ类，样品S8、S10和S9聚为第Ⅱ类。从分类结果来看，同一生产企业生产的搜风理肺丸样品归为一类，表明同一生产企业所生产样品产品质量较为稳定，不同企业间样品存在一定的质量差异，可能与搜风理肺丸所用原药材源头控制和制剂生产过程参数控制等因素差异有关。

2.5.2 主成分分析 将“2.4”项下10个批次搜风理肺丸中8种成分含量测定结果导入SPSS 26.0软件中，对10批搜风理肺丸样品进行主成分分析，以累积方差贡献率＞ 85%、初始特征值＞ 1为提取标准，主成分分析结果显示前4个主成分特征值分别为2.476、2.110、1.616和1.135，均＞ 1，曲线陡峭，后4个主成分特征值均＜ 1，曲线较为平缓，前4个主成分方差贡献率分别为30.949%、26.373%、20.206%和14.189%，累积方差贡献率达到91.717%，表明提取前4个主成分较为合理，能够代表搜风理肺丸中的大部分信息。成分矩阵结果显示白花前胡E素、去芹糖桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3对主成分1贡献较大，桔梗皂苷E和黄芩苷对主成分2贡献较大，汉黄芩苷和白花前胡乙素对主成分3贡献较大，白花前胡甲素对主成分4贡献较大。

3 讨论

3.1 色谱条件的优化选择

在搜风理肺丸定量测定中，本实验参考去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黄芩苷、汉黄芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素被检测所用流动相的相关文献，对比考察了甲醇-水[8]、甲醇-0.05%磷酸溶液[2]、乙腈-水[3-4,10]、乙腈-0.1%磷酸溶液[5]、乙腈-0.1%三氟乙酸溶液[6]、乙腈-0.1%甲酸溶液[7]等流动相体系对色谱峰分离效果的影响。结果显示，以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相梯度洗脱时，所测8种目标化合物色谱峰的峰形较好，基线较为平稳。通过对流动相比例的不断摸索优化，最终确定流动相程序对搜风理肺丸8种成分含量进行同时检测。

3.2 目标化合物的选择

搜风理肺丸由荆芥穗、紫苏梗、薄荷、前胡、陈皮、去皮炒苦杏仁、桔梗、去瓤麸炒枳壳、旋复花、竹茹、法半夏、蜜炙瓜萎子、黄芩和甘草14味中药材组方而来，所含成分共同作用，以达清热解表、宣肺止咳之功。中成药复方制剂所含成分复杂，其药理作用和临床治疗效果是所有药材共同作用的结果，多指标成分质量评价模式能够较为全面地评价其产品质量，本文依据君药所含成分为首选，同时做到兼顾臣佐使药所含成分，选取方中君药桔梗所含特征成分去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3，臣药黄芩所含药效成分黄芩苷和汉黄芩苷，以及佐药前胡所含代表性成分白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素为定量控制指标成分，以期为全面评价搜风理肺丸整体质量提供实验数据支持。

本实验采用HPLC法对搜风理肺丸中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黄芩苷、汉黄芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E素含量进行了定量控制，首次建立了该制剂多指标成分质量控制模式，同时对所测8种成分的含量结果采用化学计量学方法进行了聚类分析和主成分分析。所建立的方法符合定量分析要求，操作简单、结果准确，从含量检测结果来看，搜风理肺丸中所测成分含量存在一定的批间差异，表明建立多成分质量评价模式有利于确保产品质量的稳定性；从化学计量学统计分析结果来看，同一生产企业产品较为稳定，不同企业间产品差异较大，可能与各生产企业对制剂生产所用原药材的种属来源、产地、种植方式、采收季节、加工方法等因素差异以及制剂生产过程控制有关，提示药品生产企业和监管部门及时关注产品质量源头控制和生产过程控制，逐步完善制剂质量标准和原药材内控质量标准的建立，以确保搜风理肺丸产品质量和临床疗效的稳定性，更好地为临床合理用药提供保障。