五味子酯甲抑制头颈癌HN4细胞增殖和诱导凋亡的机制研究

曹祥燎,张 路,钱 峰,2*

(1 蚌埠医学院癌症转化医学安徽省重点实验室,蚌埠 233000;2 上海交通大学药学院;*通讯作者,E-mail:fengqian@sjtu.edu.cn)

头颈癌是发生在头颈区域的肿瘤,是当今世界上第七大最常见的癌症。目前常见的治疗方法包括手术、放疗、化疗、免疫治疗和联合治疗[1,2],由于其存在复发、转移,5年存活率仅为50%左右[3]。虽然以西妥昔单抗和派姆单抗为主的分子靶向表皮生长因子受体治疗提高了生存率,预后仍没有得到较好的结果[4,5]。由于头颈癌的耐药性和致病机制的复杂性,因此有必要寻找有效的信号通路和靶点来治疗[6,7]。

目前大部分化疗药物是通过诱导细胞凋亡阻滞细胞生长和促进肿瘤凋亡[8]。细胞凋亡主要有两种凋亡途径:固有凋亡途径和死亡受体凋亡途径。固有凋亡途径由多种细胞内和细胞外压力激发,线粒体接受到刺激后,膜电位降低,细胞色素c释放,形成凋亡小体,活化半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族成员凋亡启动者Caspase-9以及凋亡执行者Caspase-3,剪切凋亡核心成员PARP促进凋亡发生。死亡受体凋亡途径由肿瘤坏死因子受体相关凋亡诱导配体受体(TRAIL-R)活化产生,DR4和DR5是TRAIL-R的成员,位于细胞膜上,胞内含有死亡受体区域,可接受肿瘤坏死因子受体相关凋亡诱导配体(TRAIL)等影响因素刺激后,形成死亡诱导信号复合物,活化Caspase-8,下游导致一系列caspase级联反应,包括对Caspase-9,Caspase-3的剪切来促进凋亡发生[9,10]。目前发现合成或者天然化合物可以通过增加TRAIL、DR4和DR5蛋白等活化死亡受体途径诱导凋亡,而且拮抗头颈癌细胞的抗DR4单克隆抗体AY4或rhTRAIL显示出了良好的抗肿瘤效果[11,12]。因此,发展有效靶向TRAIL信号通路的候选药物对临床上治疗头颈癌显示出良好的前景。

五味子酯甲,是从五味子中分离出来的一种主要的生物活性木子素[13],是一种用于止咳、镇静的中国传统药物[14]。近年来药理特性研究发现其在肝肾缺血再灌注损伤,脑神经炎性和诱导的细胞炎性反应等有保护作用[15-17];同时也有研究显示了五味子酯甲在肿瘤中发挥良好的抗肿瘤特性,能够有效地诱导胃癌细胞凋亡的发生[18]。但是,五味子酯甲在头颈癌的抗肿瘤活性和作用机制尚不清楚,本研究的目的是探讨五味子酯甲对头颈癌细胞(HN4)的影响及其可能的作用机制,为头颈癌的临床治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 试剂

人头颈癌舌部鳞状上皮细胞HN4购自美国ATCC公司,培养于蚌埠医学院癌症医学转化中心实验室。RPMI-1640培养基,胰蛋白酶(含EDTA),双抗(青霉素/链霉素)购自美国Gibco公司;胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司;二甲亚砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO),增强的化学发光底物ECL购自美国赛默飞公司;CCK-8溶液,BCA蛋白检测试剂盒,磷酸盐缓冲水溶液购自上海碧云天公司;4%组织细胞固定液,1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.8),1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=6.8),10% SDS购自北京索莱宝科技有限公司;牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA),RNA酶,碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)购自美国Sigma公司;双染细胞凋亡检测试剂盒(Annexin Ⅴ-FITC/PI)购自杭州联科生物公司;化合物五味子酯甲(schisantherin A)购自上海陶素生物科技有限公司;药物溶解在DMSO中,瑞氏-吉姆萨染液购自南京建成科技公司,Cyclin B1、P21、DR5、DR4、cleaved Caspase-9、Cleaved PARP、GAPDH蛋白抗体购自美国CST公司。

1.2 细胞培养

人头颈癌细胞HN4培养在含10% FBS、1%青霉素/链霉素的RPMI-1640完全培养基中,37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.3 克隆形成实验检测细胞增殖

取对数生长期生长状态良好的人头颈癌细胞HN4,胰酶消化得单细胞悬液,离心,弃上清,再加入RPMI-1640完全培养基重悬细胞,计数取5×102个/孔细胞接种于6孔板中,每孔依次加入0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.1 μmol/L的五味子酯甲溶液。将6孔板放置37 ℃,5% CO2培养箱中持续培养7 d,直到对照组单细胞形成的细胞克隆数大于200个时,终止培养。弃培养液,用预先冷却的PBS溶液清洗2次细胞后,每孔加1 ml甲醇固定30 min,弃甲醇。向每孔滴加0.8 ml瑞氏-吉姆萨染色液试剂一,覆盖孔底部,染色20 min,再滴加1.6 ml瑞氏-吉姆萨染色液试剂二,充分混匀试剂一后,染色20 min,弃染液。用自来水清洗3次,晾干并拍照。计算6孔板每孔的细胞克隆数目,计算克隆增殖率,计算公式为:克隆增殖率=加药组孔克隆数/对照组孔克隆数×100%。

1.4 CCK-8实验检测细胞毒性

取对数生长期生长状态良好的人头颈癌细胞HN4,计数取5×103个/孔细胞接种于96孔板中,待细胞贴壁后,每孔依次加入0,0.05,0.1,0.5,1,2.5 μmol/L五味子酯甲溶液,将96孔板放置37 ℃,5% CO2培养箱培养24 h,每孔加入10 μl CCK-8溶液继续培养2 h,酶标仪分光度450 nm处测OD值,计算细胞在不同浓度的五味子酯甲时的细胞活力:细胞活力(%)=(实验组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)×100%。

1.5 PI染色检测细胞周期

取对数生长期生长状态良好的人头颈癌HN4细胞,计数取5×105个/孔细胞接种于12孔板中,待细胞贴壁,融合度达到90%左右时换液,每孔依次加入0,0.25,0.5,1 μmol/L五味子酯甲溶液,将12孔板放置37 ℃,5% CO2培养箱培养24 h。弃上清收集细胞于流式管中,用预先冷却的PBS溶液清洗2次后,0.4 ml的PBS溶液重悬细胞,加入到预先冷却的70%乙醇中4 ℃冰箱避光固定过夜,取出离心弃上清,0.4 ml的PBS溶液重悬细胞沉淀,加入10 μg/ml的RNase室温静置30 min,再加入50 μg/ml的PI染料染色10 min,Beckman CytoFLEX流式细胞仪(美国贝克曼库尔特生物科技有限公司)检测细胞周期分布状况,用数据处理软件分析细胞周期分布。

1.6 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染检测细胞凋亡

取对数生长期生长状态良好的人头颈癌HN4细胞,用不同浓度的五味子酯甲(0,0.25,0.5,1 μmol/L)处理HN4细胞24 h。收集上清和相对应管的细胞于同一流式管中,离心后PBS溶液清洗2次,每管加入0.4 ml的1×Annexin Ⅴ-FITC结合液混悬沉淀,从不同浓度管中分别取60 μl细胞悬液组成一管,组成三管作双阴组,Annexin Ⅴ/FITC单染组和PI单染组作对照管,实验管每管加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl PI染色液避光染色20 min,流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 Western blot法检测Cyclin B1、P21、DR5、DR4、cleaved Caspase-9、cleaved PARP、GAPDH蛋白表达

不同浓度的五味子酯甲溶液(0,0.25,0.5,1 μmol/L)处理HN4细胞24 h,胰酶消化,离心得到细胞沉淀,PBS溶液清洗2次,在冰上加入PIPA细胞裂解液裂解30 min,收集细胞总蛋白,BCA蛋白定量法测定各组蛋白浓度。加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,100 ℃煮沸10 min。每组取30 μg蛋白,10% SDS-PAGE电泳(80 V,30 min;110 V,100 min);转膜(200 mA,2 h)至NC膜;5%脱脂牛奶室温封闭2 h;用一抗稀释液1 ∶1 000稀释的抗体Cyclin B1、P21、DR5、DR4、cleaved Caspase-9、cleaved PARP、GAPDH在4 ℃孵育过夜;TBST洗涤3次,7 min/次;用二抗稀释液1 ∶4 000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ig G(H+L)二抗抗体避光敷育2 h;TBST洗涤3次,7 min/次;ECL发光试剂盒检测蛋白发光,使用仪器Tanon-5200(上海天能科技有限公司)截取图像。

1.8 统计学方法

使用GraphPad Prism 5软件对数据进行统计学分析,实验数据以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)和Tukey检验,两组间比较采用非配对样本t检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 五味子酯甲对HN4细胞的增殖抑制作用

克隆形成结果显示,HN4细胞经过不同浓度的五味子酯甲处理7 d,随着五味子酯甲浓度升高,细胞克隆形成数量明显减少。0.02,0.04,0.06,0.08,0.1 μmol/L五味子酯甲组克隆形成率分别为(96.11±1.16)%,(62.00±5.73)%,(36.66±1.58)%,(10.00±2.9)%,0%,与0 μmol/L组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05,见图1)。

2.2 五味子酯甲对HN4细胞的细胞毒性作用

用不同浓度五味子酯甲处理HN4细胞24 h,发现细胞存活率随着五味子酯甲浓度升高而下降。0.05,0.1,0.5,1,2.5 μmol/L五味子酯甲组细胞存活率分别为(90.37±8.16)%,(84.55±8.97)%,(64.02±5.43)%,(60.73±1.97)%,(57.54±0.57)%,与0 μmol/L组相比,差异具有统计学意义(P<0.05,见图2)。

图1 五味子酯甲抑制HN4细胞克隆形成Figure 1 The inhibitory effects of schisantherin A on the colony formation of HN4 cells

图2 五味子酯甲对HN4细胞的细胞毒性作用Figure 2 The cytotoxic effects of schisantherin A on HN4 cells

2.3 五味子酯甲对HN4细胞周期的影响

PI染色结果显示,不同浓度五味子酯甲作用HN4细胞24 h能显著诱导细胞S期和G2/M期阻滞。0,0.25,0.5,1 μmol/L五味子酯甲组在S期细胞分布比例为(8.47±2.97)%,(11.23±2.62)%,(40.7±2.94)%,(28.87±1.27)%;在G2/M期细胞分布比例为(7.9±0.86)%,(10.47±0.68)%,(24.4±0.69)%,(36.7±3.7)%;0.25,0.5,1 μmol/L组与0 μmol/L组相比,差异均有统计学意义(P<0.05,见图3)。

图3 不同浓度五味子酯甲处理24 h对HN4细胞周期影响Figure 3 Effect of schisantherin A on cell cycle of HN4 cells after treatment for 24 h

2.4 五味子酯甲对细胞周期相关蛋白Cyclin B1、P21表达的影响

Western blot结果显示,与0 μmol/L相比,0.25,0.5,1 μmol/L五味子酯甲作用HN4细胞24 h,细胞的Cyclin B1、P21蛋白表达量明显增加(P<0.05,见图4)。

2.5 五味子酯甲对HN4细胞凋亡的影响

细胞凋亡实验结果显示,用不同浓度五味子酯甲作用于HN4细胞24 h,随着药物浓度增加细胞凋亡率也增加。0.25,0.5,1 μmol/L的五味子酯甲三组细胞凋亡率为(13.03±0.74)%,(35.67±15.83)%,(67.8±4.57)%,与0 μmol/L组[(5.33±1.3)%]相比,差异具有统计学意义(P<0.05,见图5)。

2.6 五味子酯甲对细胞凋亡相关蛋白和DR4/DR5蛋白表达的影响

Western blot结果显示,与0 μmol/L相比,0.25,0.5,1 μmol/L的五味子酯甲作用于人头颈癌HN4细胞24 h,细胞的DR5、DR4、cleaved Caspase-9、cleaved RARP蛋白表达量明显上调(P<0.05,见图6)。

图4 免疫印迹法检测五味子酯甲对HN4细胞Cyclin B1和P21蛋白表达的影响Figure 4 Effect of schisantherin A on the protein expression of Cyclin B1 and P21 in HN4 cells by Western blot

图5 不同浓度五味子酯甲处理24 h对HN4细胞凋亡的影响Figure 5 Effect of schisantherin A on the apoptosis of HN4 cells after treatment for 24 h

图6 免疫印迹法检测不同浓度五味子酯甲对HN4细胞DR5、DR4、Cleaved Caspase-9、cleaved PARP蛋白表达的影响Figure 6 Effect of schisantherin A on the expression of DR5, DR4, cleaved Caspase-9, cleaved PARP in HN4 cells by Western blot

3 讨论

头颈癌作为异质性肿瘤,发病位点较多,发病机制复杂。虽然治疗方法有所改进,但治疗效果不太理想,过去几十年的头颈癌生存率并没有明显提高。因此,寻找新的药物及有效机制诱导细胞凋亡成为治疗头颈癌的一个重要方向。五味子酯甲是一种活性很强的单体化合物,以往的研究主要是围绕化合物的抗炎性和抗损伤作用展开,而本研究探究其对头颈癌细胞的抗癌作用效果。研究结果显示,五味子酯甲能抑制细胞增殖和减少细胞克隆数目,能诱导HN4细胞S期和G2/M期阻滞和调控细胞周期蛋白Cyclin B1以及P21表达的增加,也能诱导caspase依赖性的凋亡和调控死亡受体蛋白DR5以及DR4的表达增加。

由于癌细胞的快速增殖特性,靶向细胞周期成为抗癌药物治疗的有效策略[19]。p21是细胞周期依赖性激酶抑制剂,在细胞周期两个主要检查点G1/S期和G2/M期均能发挥周期抑制作用[20]。p21可与Cyclin B1-CDC2复合物结合后,促使细胞G2/M期阻滞,汉防己甲素(tetrandrine)可通过增加P21蛋白表达使胰腺癌PANC-1和BxPC3细胞G2/M期阻滞和增殖抑制[21],重楼皂甘(polyphyllin G)通过增加P21和减少Cyclin B1的表达促使头颈癌OCEM-1细胞G2/M期阻滞[22]。而本研究中发现五味子酯甲作用头颈癌HN4细胞除了P21蛋白表达增加和G2/M期阻滞外,Cyclin B1蛋白表达增加和细胞S期阻滞,显示了与重楼皂甘作用于头颈癌细胞的不同结果,可能与其他调控机制有关。

相比于传统药物的细胞毒性和肿瘤耐受,TRAIL通过促凋亡蛋白DR5和DR4的表达选择性诱导凋亡且对正常细胞没有毒性,显示了良好的治疗前景。研究发现,土荆乙酸(pseudolaric acid B)通过增加DR5蛋白和激活下游caspase信号通路抑制头颈癌HN22细胞增殖和促进细胞凋亡,同时体内实验也显示化合物有效抑制肿块生长且没有器官损害和体重减轻等副作用[23],8-羟基喹啉通过促进DR5和DR4蛋白同时表达和增加细胞内氧化水平来增加头颈癌SCC25细胞凋亡[24],表明化合物可以有效地通过增加死亡受体蛋白DR4和DR5表达诱导头颈癌细胞凋亡。也有研究显示,由于不同肿瘤中DR4和DR5的表达水平不同,因而抗DR4或抗DR5抗体作用肿瘤后凋亡水平也有差异,由于头颈癌细胞HN6和OSCC3表面DR4蛋白含量较低使TRAIL诱导凋亡水平较低[12],而同时抗DR4和DR5的重组抗体rhTRAIL能最大限度地激活死亡受体途径,促进肿瘤凋亡[25]。本研究结果显示五味子酯甲能同时诱导DR5和DR4的表达,通过线粒体途径的Caspase-9蛋白剪切,引起caspase级联反应以及凋亡核心蛋白RARP的剪切诱导凋亡发生,表明了死亡受体蛋白DR4和DR5是五味子酯甲抑制头颈癌的有效靶点。

天然化合物具有较强的生物活性,因其安全、较少的毒性作用、抗氧化、易获得性等原因,成为获取化疗药物的理想来源[26]。目前天然化合物在治疗癌症中显示了良好的效果,姜黄素可以通过靶向pSTAT3和Nrf-2信号通路辅助顺铂对头颈癌治疗效果,且能减少顺铂治疗相关的耳毒性不良反应[27]。五味子酯甲作为从植物中提取出来的天然化合物,近年来研究中显示了一系列药理活性作用[28]。五味子酯甲能通过阻断MAPK和NF-κB信号通路发挥抗IL-1β刺激的软骨细胞的炎性作用,也能通过阻断MAPK信号通路来减轻肝缺血再灌注损伤[15-17],也有研究显示,五味子酯甲通过MAPK信号通路发挥了抗肿瘤效果,在胃癌中通过活化JNK信号通路促进细胞周期G2/M阻滞和诱导细胞凋亡发生,且在作用浓度内对巨噬细胞样细胞Raw264.7的增殖没有显著影响[18],提示五味子酯甲在较低浓度范围内的药理活性,且较低作用浓度对正常细胞没有损伤。因此五味子酯甲以其多种药理活性和低毒副作用的特性,为其成为理想的化疗药物提供了可能。

综上所述,本研究结果表明五味子酯甲具有抑制头颈癌HN4细胞增殖,诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡的作用;其机制可能与caspase级联反应的激活和DR5与DR4相关的死亡受体途径通路的激活有关。本研究显示了五味子酯甲具有治疗头颈癌的作用,为进一步探究五味子酯甲抗癌治疗提供了依据,但详细机制有待进一步的实验证明。