丁卡因通过MDM2基因下调Survivin蛋白抑制黑色素瘤生长

伍春林,易 鹏,黄 祥,冯建国,姜 鲜,2*

(1 西南医科大学附属医院麻醉科，泸州 646000；2 泸州市人民医院麻醉科;*通讯作者,E-mail:jiangkeke303@163.com)

黑色素瘤是一种侵袭性极强的恶性肿瘤，是发病率增长最快的恶性肿瘤之一[1]。临床研究表明，早发现并尽早进行手术切除是治疗黑色素瘤的最佳选择[2]。而术后原发肿瘤的复发和转移是患者预后不良的主要原因[3]。回顾性研究表明，局麻药的使用在减少术后原发肿瘤复发和转移中起到积极的作用[4,5]。大量的证据也表明局麻药可以通过直接细胞毒性和诱导细胞凋亡，抑制增殖、迁移和侵袭，以及通过甲基化调节基因表达等表现出显著的肿瘤抑制作用[6]。局麻药可通过多种作用机制抑制癌细胞的生长和转移，并随局麻药的种类、浓度及癌细胞类型而不同[7]，因此局麻药抑制肿瘤的分子机制还需深入探究。Werdehausen等[8]和Kobayashi等[9]的研究表明丁卡因似乎具有较强的肿瘤抑制效力。而目前关于丁卡因对肿瘤作用的研究较少，且缺乏机制研究。为此，本研究就局麻药丁卡因对黑色素瘤生长的影响及机制展开研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药品 盐酸丁卡因(天兴)，溶于无菌生理盐水中配置成0.2 mol/L的母液，随后根据实验需求用细胞培养基配成0，0.1，0.15，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L的培养液，现配现用。

1.1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清、高糖DMEM(美国Hyclone)，MTT试剂、BCA试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，MDM2抗体(美国Santa)，Survivin抗体(中国ZEN BIO公司)，GAPDH抗体(中国Proteintech公司)，CO2培养箱(美国Thermo Scientific)，全自动酶标仪(美国Bio-Tek)，电泳仪、湿转槽(美国Bio-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A375和B16黑色素瘤细胞为西南医科大学麻醉实验室常规保存。A375和B16均采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养，单层贴壁培养于CO2培养箱中(37℃，5%CO2)。当细胞融合度达到70%-80%时进行实验。

1.2.2 MTT法检测丁卡因对黑色素瘤细胞活力的影响 取对数生长期的黑色素瘤细胞(A375和B16)，胰酶消化、细胞计数后，A375(3×104个/ml)和B16(1×104个/ml)接种于96孔板，每孔100 μl。过夜后，A375细胞予以0，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L丁卡因干预24 h；B16细胞则予以0，0.1，0.15，0.2，0.3 mmol/L丁卡因处理24 h。小心吸弃上清液，每孔加入100 μl含10 μl MTT的新鲜培养液，4 h后更换为100 μl二甲基亚砜孵育15 min。用酶标仪测量560 nm处的光密度值(optical density，OD)，认为0 mmol/L组的细胞活力为100%，作为对照，抑制率=(1-丁卡因组OD560/对照组OD560)×100%，计算IC50。

1.2.3 细胞集落实验检测丁卡因对黑色素瘤增殖能力的影响 将生长良好的A375和B16细胞均匀接种于6 cm培养皿(A375：1×103个/皿，B16：600个/皿)，随机分为对照组、丁卡因0.05 mmol/L组、丁卡因0.10 mmol/L组、丁卡因0.15 mmol/L组，相应地予丁卡因0，0.05，0.10，0.15 mmol/L干预24 h后，更换新鲜培养基继续培养待集落形成，结晶紫染液染色后计数集落(大于或等于50个细胞的集落)。

1.2.4 Western blot检测Survivin及MDM2的表达水平 取融合度约为70%-80%的黑色素瘤细胞A375和B16，予丁卡因处理24 h(根据1.2.2中IC50结果，A375细胞予0.4 mmol/L丁卡因，B16细胞予0.2 mmol/L丁卡因)，对照组给予等体积生理盐水处理24 h。用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，提取蛋白，BCA蛋白定量后制备蛋白样品。经12% SDS-PAGE凝胶电泳分离后，电转至NC膜，在室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h，随后洗膜并转入相应一抗中(Survivin 1 ∶1 000、MDM2 1 ∶200、GAPDH 1 ∶5 000)，于4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入相应二抗中室温孵育1 h，再次洗膜，ECL显影、曝光成像。分析丁卡因干预后细胞中相应蛋白变化(Image J软件)。

1.2.5 动物实验 取12只雄性BALB/C小鼠(成都达硕，6-8周龄，体质量21-26 g)随机分为对照组(n=6)和丁卡因组(n=6)，均于小鼠右侧背部皮下注入B16细胞0.1 ml(约5×106个)，待小鼠背部成瘤后，丁卡因组经腹腔注射丁卡因干预(20 mg/kg)，对照组经腹腔予等体积生理盐水作为对照，隔天给药，1周后取下肿瘤组织，观察肿瘤组织大小并称重记录。

1.2.6 免疫组化法检测肿瘤组织中Survivin的蛋白表达水平 将肿瘤组织于4%多聚甲醛中固定，经蔗糖梯度脱水，石蜡包埋后切片，依次进行：脱蜡；水化；抗原修复；血清封闭孵育；滴加Survivin抗体；孵相应二抗；显色剂显色；复染后梯度脱水；二甲苯透明；中性树胶封片。观察并拍照后分析Survivin表达变化(Image J)。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，两组间比较采用独立t检验，多组采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丁卡因抑制黑色素瘤细胞活力

丁卡因显著抑制了黑色素瘤细胞A375和B16的细胞活力，呈浓度依赖性(见图1)。与空白对照相比，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L丁卡因干预24 h，A375细胞活力分别被抑制24%，48%，81%，93%，差异有统计学意义(P<0.001)，半数抑制率(IC50)约为0.41 mmol/L。0.1，0.15，0.2，0.3 mmol/L丁卡因处理24 h，B16细胞活力分别被抑制14%，51%，62%，92%，差异有统计学意义(P<0.001)，B16细胞半数抑制率(IC50)为0.16 mmol/L。丁卡因对于B16细胞的IC50低于对A375细胞的IC50，差异有统计学意义(P<0.001)。

2.2 丁卡因抑制黑色素瘤细胞集落形成

集落实验结果显示，0.05，0.10，0.15 mmol/L丁卡因分别干预黑色素瘤细胞A375和B16后，与对照组(0 mmol/L)相比，丁卡因组集落数量随丁卡因浓度增加逐渐减少(P<0.001，见图2)。

与对照(100%)相比，* * * P <0.001图1 丁卡因对黑色素瘤细胞活力的影响Figure 1 Effect of tetracaine on cell viability of melanoma

与对照组(0 mmol/L)相比，* * * P <0.001图2 丁卡因对黑色素瘤细胞集落形成的影响Figure 2 Effect of tetracaine on colony formation of melanoma

2.3 丁卡因下调Survivin和MDM2蛋白的表达

本实验检测了丁卡因干预后黑色素瘤细胞内Survivin蛋白及其上游蛋白MDM2的表达变化，结果显示，在A375及B16细胞中，丁卡因干预后MDM2蛋白的表达明显下调(P<0.001)；同时Survivin蛋白的表达也明显减少(P<0.001，见图3)。

2.4 丁卡因抑制小鼠皮下黑色素瘤的生长

实验过程中未观察到小鼠出现明显不良反应。实验结束时对照组取得6个明显瘤体；丁卡因组取得4个明显瘤体，另外两只小鼠解剖皮下后仅可见黑斑残余(质量记为0 g)。与对照组相比，腹腔注射丁卡因可明显抑制小鼠皮下黑色素瘤的生长，其瘤体质量明显降低(P<0.05，见图4)。

与对照组相比，* * * P <0.001图3 丁卡因对黑色素瘤中MDM2和Survivin蛋白表达影响Figure 3 Effect of tetracaine on the expression of MDM2 and Survivin proteins in melanoma

图4 丁卡因对小鼠皮下黑色素瘤的影响Figure 4 Effect of tetracaine on the growth of subcutaneous melanoma in mice

2.5 丁卡因使黑色素瘤组织中Survivin蛋白的表达下降

相比于对照组，丁卡因组黑色素瘤组织中Survivin蛋白表达明显减少(P<0.001，见图5)，提示丁卡因下调了黑色素瘤组织中Survivin蛋白的表达。

图5 丁卡因下调黑色素瘤组织中的Survivin (DAB染色)Figure 5 Tetracaine down-regulates the level of Survivin in melanoma tissue (DAB staining)

3 讨论

虽然局麻药经常用于肿瘤患者的外科手术及癌痛的控制，但局麻药在肿瘤生物学中的意义尚不清楚[5]。临床证据表明局部麻醉能够影响肿瘤术后转移的病理生理过程并减少肿瘤的复发，包括乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌以及黑色素瘤[5,6,10-12]。然而是局麻药本身的作用还是麻醉技术的影响抑或是它们的联合作用抑制了肿瘤的进展需要进一步探索。在本研究中，我们采用黑色素瘤模型探究了酯类局麻药丁卡因的抗肿瘤作用。此外，我们还建立了小鼠皮下黑色素瘤模型，研究了丁卡因在活体上的抗肿瘤作用。丁卡因在细胞及动物水平上都能明显抑制黑色素瘤，这为丁卡因在肿瘤手术及术后镇痛、癌痛镇痛等方面提供了潜在应用价值。

我们首先通过A375和B16两种黑色素瘤细胞系研究了丁卡因对肿瘤的作用。A375是人来源的黑色素瘤，B16是鼠来源的黑色素瘤。A375和B16在黏附蛋白、营养因子的产生和基因图谱等重要方面有差异，具有不同的遗传特点，是研究黑色素瘤的常用细胞系[13]。结果显示，丁卡因以浓度依赖的方式抑制黑色素瘤A375和B16细胞活力，IC50分别为0.41 mmol/L和0.16 mmol/L。值得注意的是，丁卡因对B16细胞的IC50明显低于A375细胞的IC50(P<0.001)，具有较高增殖能力的B16对丁卡因的反应更加敏感。此前Gregoire等[14]也发现罗哌卡因对HuH7和人肝癌祖细胞的影响比对分化的人肝癌细胞影响更明显。这可能是因为局麻药对高增殖能力的细胞比低增殖能力细胞的作用更强。从机制上来说，局麻药可能通过靶向某些促进肿瘤细胞增殖能力的信号通路或离子通道或受体发挥作用。

单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。细胞集落形成实验可以反应细胞的增殖能力。在我们的研究中，丁卡因以浓度依赖的方式抑制A375和B16的集落形成。我们发现0.05 mmol/L丁卡因能够抑制A375和B16的集落形成能力，但此浓度的丁卡因对于A375和B16的细胞活力基本没有明显影响，这和此前报道的罗哌卡因在较低浓度时就表现出抑制肿瘤细胞增殖，但没有细胞毒性作用相一致[15,16]。因此，不同浓度的丁卡因对黑色素瘤具有不同的抑制作用，在较低浓度主要表现为增殖抑制作用，在较高浓度则表现为直接的细胞毒性作用。

为进一步研究丁卡因在活体上对黑色素瘤的抑制作用，我们建立了小鼠皮下黑色素瘤模型，并通过腹腔注射丁卡因治疗小鼠。结果显示，丁卡因明显抑制了小鼠皮下黑色素瘤的生长。但其对免疫的影响不清楚，其是否可以通过增强T细胞对肿瘤的杀伤作用也未知。实验期间未观察到小鼠出现明显不良反应，腹腔注射丁卡因(20 mg/kg)对于BALB/c小鼠是一种可行的治疗方式。综上，丁卡因可能是一种有前景的抗黑色素瘤药物。但目前关于其机制和临床应用的研究有限，对于其机制和临床应用的研究探索将有利于癌症手术患者的预后。

Survivin，细胞凋亡抑制家族(IAPs)成员，是IAPs家族中抗凋亡能力最强的蛋白之一。Survivin在肿瘤中呈高表达且可以抑制肿瘤细胞的凋亡,从而促进肿瘤的发生、增殖及对化疗的耐药性[17]。Survivin的高表达是侵袭性和转移性黑色素瘤的共有特征，在黑色素瘤细胞系中使用反义或显性阴性突变体就足以引起细胞凋亡[18]。在本研究中，我们先发现了丁卡因使得黑色素瘤细胞A375和B16中Survivin的表达下调，追溯Survivin的上游蛋白MDM2发现其表达也下降，丁卡因可能是通过MDM2-Survivin通路介导黑色素瘤的死亡的。此外我们在小鼠皮下肿瘤模型得到了一致的结果：丁卡因抑制小鼠皮下黑色瘤的生长，丁卡因组瘤体组织Survivin蛋白表达减少。这说明，丁卡因发挥抗黑色素瘤的作用可能是通过MDM2下调Survivin表达实现的。

综上所述，丁卡因在细胞水平及活体动物上都显现出强有力的抗黑色素瘤(A375和B16)作用，这可能与其通过MDM2下调Survivin的表达相关。