黄骅市特产虾酱中优势细菌的分离鉴定及抗性研究

陈依淼，刘伟,2，于泽，牛雅宁，姜宝杰*

(1.河北农业大学 理工系，河北 沧州 061100；2.河北农业大学 食品科技学院，河北 保定 071001)

虾酱是渤海等中国沿海地区以及东南亚地区等的特色调味品，它是用虾丝加入盐并研磨成的黏稠状进而经过发酵后的酱食品[1]，是许多料理的必备调味品之一。虾酱在长时间的贮藏发酵过程中发生了一系列反应，包括蛋白质分解为氨基酸、脂肪转化为脂肪酸等，同时钙元素经过一系列化学变化易于被人体吸收。所以，虾酱具有独特的风味，同时也是优质蛋白质、脂肪酸和钙的来源[2]。

在虾酱的生产过程中，同时进行了微生物变化和生化反应。自然发酵产品的微生物菌群在产品感官、品质中起着重要的作用[3]。本文采用菌种筛选纯化培养的方法，从黄骅市特色虾酱(高盐虾酱和低盐虾酱)中分离筛选优势细菌[4]。分离纯化得到的有益菌株可作为微生物农药、生防菌载体等[5-6]，对于生物学改造和食品的生产工艺改善具有研究价值，为今后在调味品生产中开发和利用乳酸菌提供了理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要试剂和样品

本实验所用的高盐和低盐虾酱在黄骅市当地购买，乙醇为北京化工厂生产，其他试剂均为国药集团生产。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 MRS培养基

准确称量20 g蛋白胨、10 g酵母膏、20 g牛肉膏、4 g柠檬酸氢二铵、40 g葡萄糖、2 mL吐温80、10 g乙酸钠、4 g磷酸氢二钾、1.16 g硫酸镁、0.5 g硫酸锰、36 g脂。

将上述成分加入到含有2 L蒸馏水的烧杯中，充分加热溶解，再转移至2 L容量瓶中，定容。分装于500 mL锥形瓶后，于121 ℃高压灭菌15 min，备用。

1.1.2.2 LB培养基：

在475 mL H2O中加入胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g。用1 mol/L的NaOH调节pH值至7.0，定容至100 mL，于121 ℃高温灭菌15 min，备用。

1.1.3 主要试剂与仪器

实验所需的仪器见表1。

表1 实验仪器和设备Table 1 The experimental instrument and equipment

1.2 实验方法

1.2.1 细菌的分离筛选

在无菌条件下取少量均质后的虾酱样品放置于烧杯中，用无菌水进行10倍梯度浓度稀释，稀释倍数为101～105倍。分别取0.2 mL稀释倍数为103、104、105的菌液涂布在MRS固体培养基上，每个浓度做3个平行实验，且每组设置一个相同条件的空白对照培养基，37 ℃培养72 h，观察菌落形态并记录。

挑取单菌落，平板划线MRS培养基在37 ℃纯化培养48 h。观察菌落在平板中的形态，革兰氏染色后镜检，若菌落形态不单一，则存在杂菌。重复上述操作，直至在进行显微镜检测时菌落形态单一，甘油保存备用。

1.2.2 菌株的分子生物学鉴定

以液体LB培养的菌液为模板，采用通用引物27f/1492r 扩增16S rDNA，PCR体系及程序参考其他文献报道方法[7-8]。 PCR体系(50 μL)：ddH2O 32 μL、菌液5 μL、PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL、上下游引物各1.5 μL和ExTap 1 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s；45 ℃退火30 s；72 ℃延伸 30 s，35个循环；72 ℃延伸 10 min。

电泳检测条带单一后，PCR 产物送交天津擎科生物公司进行测序分析。

1.2.3 菌株的抗生素抗性实验

使用MRS固体培养基为基本培养基，将培养基灭菌后分别加入浓度为100，200，500，1000 μg/mL的无菌氨苄溶液[9]，振荡混匀倒板，并设置空白对照组，每组3个平行实验。在平板中滴加5 μL的菌液进行培养，37 ℃培养2 d后用十字测量法测量菌落直径d(cm)并记录。

1.2.4 菌株产酸能力特性实验

因为所分离出的细菌大部分是乳酸菌，所以对其产酸能力进行测定。将菌株接种到含有5%浓度的CaCO3的MRS夹层固体培养基进行培养，在37 ℃培养2 d后用十字测量法测量一次菌落直径D(cm)和溶钙圈直径d(cm)。以溶钙圈直径d(cm)/菌落直径D(cm)×100%计算溶钙圈直径比值[10]。

1.2.5 生长曲线的测定

对GYXJ-1菌株生长速度进行生长曲线的测定。将提前活化的种子液按10%接种量(15 mL)接种至装有135 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中，于37 ℃下200 r/min摇瓶培养。分光光度仪预热结束后，在波长600 nm的紫外光下进行测定，每1 h取样一次，同时准备空白培养基进行对比测量，测OD600 nm值，连续测定24 h。以时间为横坐标，OD600 nm值为纵坐标绘制生长曲线图[11-12]。

2 结果与分析

2.1 菌株形态学观察

从低盐虾酱样品中共分离得到10株菌，编号为 XJ-1、XJ-2、XJ-3、XJ-4、XJ-5、XJ-6、XJ-7、XJ-8、XJ-9、XJ-10。从高盐虾酱样品中共分离得到7株菌，编号为GYXJ-1、GYXJ-2、GYXJ-3、GYXJ-4、GYXJ-5、GYXJ-6、GYXJ-7。将这些菌划线接种于MRS 固体培养基上，培养48 h后，MRS 固体培养基上有较小的单一菌落出现，所有菌落均呈现饼状，乳白色，表面光滑，菌落中央呈峰状。镜检菌株呈球状单个或成对，无芽孢存在，革兰氏染色均为阳性[13]。

2.2 菌株的分子生物学鉴定

将分离的17 株细菌菌株的16S rDNA分析结果进行序列分析，结果发现来自于高盐虾酱的7株菌均属于葡萄球菌，其中4株菌属于腐生葡萄球菌，2株属木糖葡萄球菌，1株属阿尔莱特葡萄球菌；来自于低盐虾酱的10株菌全部属于格氏乳球菌，见表2。

表2 菌种鉴定表Table 2 The identification of strains

2.3 菌株的氨苄抗性研究

运用琼脂稀释法，通过十字交叉法测量菌落直径对培养成功的17株菌株进行耐药性检验，结果见表3。结果显示：GYXJ-2、GYXJ-4、GYXJ-6、XJ-7和XJ-8对氨苄有非常强的抗性，即使在氨苄浓度为1000 mg/L条件下，其生长也不受影响。此外，GYXJ-1、GYXJ-3、XJ-4和XJ-6对氨苄均有不同程度的抗性。其余8株菌对氨苄的耐受性较差，即使在100 mg/L浓度条件下依然不能生长。

表3 菌种的氨苄抗性表Table 3 The resistance of ampicillin of strains

2.4 菌株产酸能力特性研究

测定了从低盐虾酱中分离出的10株乳球菌的溶钙圈水平，用以鉴别其产酸能力，结果见图1。结果显示：溶钙能力最高的是XJ-4，溶钙圈直径比值是114.38%；溶钙圈能力最低的是XJ-1，溶钙圈直径比值是104.02%。由结果可知，这些菌株均有明显的溶钙圈，说明这10株乳酸菌菌株均具有良好的产酸能力[14-15]。

图1 各菌株产生的溶钙圈直径比Fig.1 The diameter ratio of dissolued calcium produced by each strain

2.5 生长曲线测定

为了更好地研究黄骅虾酱中细菌的生长规律，以GYXJ-1为研究菌株，测定了它的生长曲线。以时间为横坐标，OD600 nm值为纵坐标绘制生长曲线图，结果见图2。乳酸菌的生长曲线说明前2 h是该菌的延滞期，在此期间菌几乎不繁殖，这是因为菌株处在新的生长环境，需要进行环境的适应，通过吸收营养物质产生为细胞分裂做准备的辅酶和产物。在对滞后期进行短暂(约2 h)调整后，进入对数生长期，在此期间菌体呈指数倍增。11 h后进入稳定期，在15 h时菌体密度达到最高，死亡菌的数量逐渐超过新生菌的数量，并且种群中的活细菌数量减少，所以在15 h后OD值出现些许下降,结果表明该菌呈现出典型的细菌生长规律。

图2 GYXJ-1的生长曲线Fig.2 The growth curve of GYXJ-1

3 结论

本文通过对从黄骅特产虾酱中分离筛选的17株优势细菌进行形态鉴定与分子鉴定，确定了优势细菌中7株属葡萄球菌，10株属格氏乳球菌。测定了格氏乳球菌产酸能力，发现均具有良好的产酸能力。对17株菌的耐药性进行了检测，显示17株菌中5株菌对氨苄具有非常强的耐受性，4株菌对氨苄有较强的抗性，其余8株菌对氨苄表现出不耐受性。