伯克霍尔德氏菌YZU-S230对西瓜枯萎病的防效及其促生作用

孙正祥，孟祥佳，龙欣钰，邱美莎，毛国庆，周燚

1.长江大学农学院,湖北 荆州 434025 2.湖北省农林病虫害预警与调控工程技术研究中心(长江大学)，湖北 荆州 434025

由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)侵染引起的西瓜枯萎病是一种土传的系统性病害，是西瓜的重要病害之一，在西瓜的整个生育期均可发生，对西瓜的产量和品质构成巨大的威胁[1]。目前西瓜枯萎病的防治方法主要有农业防治、抗病育种和化学药品防治，其中化学防治因其效果好、成本低而成为了主要的病害防治手段[2,3]。但长期使用同一种农药易使病原菌产生抗药性，且其大量残留会杀死土壤中的有益微生物，同时对人类健康构成威胁，不宜长期使用[3-5]。生防菌剂防治因其具有对植物病害的良好防效和对环境无污染等特点，逐渐受到了人们的重视[6-8]。

生防细菌具有适应环境能力强、营养需求简单、定殖能力强等优点，成为植物病害生物防治研究的热点。目前，芽孢杆菌属(Bacillussp.)和假单胞菌属 (Pseudomonassp.)已成功应用于植物病害生物防治领域。但伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)应用于生物防治的研究较少[9]。菌株YZU-S230是由长江大学植物与微生物互作研究室前期分离得到的一株生防细菌，经鉴定为伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)，具有广谱的抑菌活性且对水稻纹枯病具有良好的盆栽防效。该研究通过盆栽试验测定了YZU-S230对西瓜枯萎病的盆栽防效和对西瓜植株的促生作用及其定殖动态，旨在为西瓜枯萎病的生物防治提供更多的菌源，也为后期探究生防细菌与病原菌、寄主的互作关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株包括西瓜枯萎病病菌(F.oxysporumf.sp.niveumFON)和伯克霍尔德氏菌YZU-S230和YZU-S230gfp(将pBBR1MCS2-Tac-EGFP质粒导入YZU-S230，由长江大学植物与微生物互作研究室前期转化完成)。供试西瓜为西农八号，由西北农林科技大学选育。供试培养基包括LB培养基和PDB培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 YZU-S230对西瓜枯萎病菌的抑菌作用

采用平板对峙法[10]，选取培养3d的西瓜枯萎病原菌菌饼(5mm)接种至PDA平板中央，在平板两侧距平板中央各2.5cm的地方平行划线接种菌株YZU-S230，于28°C培养箱中培养。 每个处理3次重复，7d后测量各处理和对照(CK)的菌落直径并计算抑菌率。

1.2.2 西瓜幼苗的培养

挑选健康的大小一致的西瓜种子,按常规方法进行表面消毒[11]，随后将其放入含有湿棉花的培养皿中，于28℃培养箱中培养。待种子露白后将其播种至含有无菌基质土的育苗盘中，待西瓜幼苗长出第3片真叶后将其移栽至装有无菌基质土的盆钵中，用于后续试验处理[12]。

1.2.3 YZU-S230对西瓜植株的促生作用

将活化好的YZU-S230 接种到LB培养基中，28℃、130r/min 震荡培养4d，用分光光度计将其浓度调至光密度D600nm=1.0。采用灌根法接种生防细菌，每株西瓜幼苗接种20mL，以接种等量的LB为对照，每处理3次重复，各有西瓜苗15株[13]。接种30d后记录西瓜植株的株高、根长、叶绿体含量和鲜重等数据[13]。

1.2.4 YZU-S230对西瓜枯萎病的盆栽防效

盆栽试验设置3个处理:①西瓜枯萎病菌(FON)+提前3d接种YZU-S230；②FON+同时接种YZU-S230；③FON+LB。

将西瓜枯萎病菌接种至PDB培养基中，于28℃、130r/min的摇床中震荡培养，5d后用血球计数板检测培养液中西瓜枯萎病菌孢子的浓度，接种时将孢子液与无菌基质土进行混合制成病土，使每克基质土含有1.0×105cfu个分生孢子[15,16]。细菌的培养和接种参照1.2.1。以接种LB为对照，每处理 3次重复，各有西瓜苗15株。接种30d后调查各处理西瓜植株的发病严重度，计算相应的病情指数和相对防效[17]。

1.2.5 YZU-S230在西瓜根部的定殖动态

将活化后的菌株YZU-S230gfp接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，28℃、130r/min震荡培养，4d后用分光光度计将培养液浓度调至光密度D600=1.0，其接种方法参照1.2.1。分别在接种后1、3、5、7、9、15、21、30d采集西瓜苗，采用稀释涂布法分离其根部内生细菌[18]，取100μL 研磨液涂布于含卡那霉素的LB固体平板上，28℃培养箱中培养2d后对平板上的菌落进行计数，计算菌株在西瓜根部的定殖数量[19,20]。另取上述不同时间的西瓜苗根部组织，用无菌水冲洗干净后在冷冻切片机上切成薄片，并将其制成玻片，于荧光显微镜下观察菌株YZU-S230gfp在西瓜根部组织中的定殖动态[21]。

1.2.6 数据分析

采用SPSS软件对所获得的数据进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 YZU-S230对西瓜枯萎病菌的抑菌作用

图1 YZU-S230对西瓜枯萎病菌的抑菌作用Fig.1 Inhibition effect of YZU-S230 on watermelon Fusarium wilt

平板对峙试验表明,对照组西瓜枯萎病菌平均菌落直径为81.84mm，处理组西瓜枯萎病菌平均菌落直径为18.22mm(见图1)。菌株YZU-S230对西瓜枯萎病的抑制率为82.80%。

2.2 YZU-S230对西瓜植株的促生作用

促生长试验结果表明,经YZU-S230处理后30d，西瓜植株的地上鲜重、主蔓长和根长都显著大于对照组，其中地上鲜重与对照相比增加了6.9g，主蔓长和根长分别增加了8.7cm和3.0cm(表1)。

表1 菌株YZU-S230对西瓜的促生作用Table 1 Growth promotion of strain YZU-S230 on watermelon

2.3 YZU-S230对西瓜枯萎病的盆栽防效

盆栽防效试验结果显示，处理30d后，只接种病原菌时西瓜苗的发病率是100%，而用菌株YZU-S230处理后其发病率为60%，且接种生防菌的植株病情指数都显著低于对照。此外，提前3d接种菌株YZU-S230时其对西瓜枯萎病的防效可达68.40%，明显高于同时接种时的防效(30.87%)(表2、图2)。

表2 YZU-S230对西瓜枯萎病的盆栽防效(接种30d后)Table 2 Control effect of strain YZU-S230 on watermelon Fusarium wilt in pot experiment(30 days ofter inoculation)

2.4 YZU-S230在西瓜根部的定殖动态

图2 菌株YZU-S230对西瓜枯萎病的盆栽防效Fig.2 Control effect of strain YZU-S230 on watermelon Fusarium wilt in pot experiment

图3 不同时间下YZU-S230在西瓜根部的定殖数量Fig.3 Colonization number of YZU-S230 in watermelon roots at different times

定殖试验结果显示，YZU-S230gfp不仅能在西瓜植株根表稳定定殖，还能进入根内定殖。该菌株在西瓜根部可持续定殖30d，其数量先增后减，随后趋于稳定，第21天时其定殖数量仍可达1.2×105cfu/g(见图3)。镜检结果表明，YZU-S230gfp在荧光显微镜下能发出明显的绿色荧光，在根组织中的数量也呈现出先增后减的趋势(见图4)。

图4 YZU-S230gfp在西瓜根部的定殖动态Fig.4 Colonization dynamics of YZU-S230gfp in watermelon roots

3 讨论与结论

西瓜枯萎病是世界上十分严重的土传病害之一，目前没有安全有效的防治方法[22]。利用植物内生细菌以及根际细菌抑制病原菌是生物防治的重要手段和方法。已有研究表明，植物内生细菌与根际细菌具有促进植物种子萌发、增强植物抗病能力、促进植物幼苗生长的作用[23,24]。菌株YZU-S230是从白芨根部分离的一株内生细菌，前期试验表明该菌株对水稻纹枯病的盆栽防效显著，而笔者的研究表明其对西瓜枯萎病具有良好的盆栽防效，对西瓜植株具有促生长作用。

生防菌在植物体内的有效定殖是其发挥生防效果的重要条件之一，因此测定生防菌的定殖能力已成为目前研究生防菌作用机制的重要内容[25]。研究采用抗生素标记法[25]检测了菌株的定殖能力，结果显示西瓜根部YZU-S230菌量在第3天出现高峰后迅速下降，这可能与西瓜在此时生长迅速有关，生物量迅速增加导致植株内的YZU-S230菌量相对下降。21d后，菌株YZU-S230和植物苗的生长达到一个相对平稳的状态，此时单位鲜重植物组织中的YZU-S230菌量也达到一个相对稳定状态，表明菌株YZU-S230能与西瓜植株形成共生关系，可以在西瓜植株内长期稳定定殖并发挥防治西瓜枯萎病的作用[27]。

室内环境与田间环境区别较大，导致菌株在田间试验中的防治效果远低于实验室中的防治效果。菌株YZU-S230能否在田间稳定发挥其生防机制还需通过下一步的田间试验进行探究。其产生的抗菌活性物质的稳定性(温度、紫外光)是该菌株能被制成生防菌活菌剂，并与农业生产的实际情况相结合的关键。因此，对菌株YZU-S230产生的抗菌活性物质的研究是后期工作的重点。