沉默calnexin对舌鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

钟齐健， 金婷婷， 彭毓， 陈伟雄， 李劲松

1.中国科学院大学深圳医院（光明）口腔科，广东 深圳（518106）； 2.广州中医药大学附属深圳市龙岗中心医院口腔科，广东 深圳（518116）; 3.中山大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科，广东 广州（510120）

舌鳞状细胞癌是最常见的口腔癌。尽管近年来影像诊断、外科治疗、放射治疗和化学治疗等方面取得了长足进步，但舌鳞状细胞癌患者的5 年生存率仅略有提高［1-2］。舌鳞状细胞癌的具体发病机制尚未完全阐明，因此揭示舌鳞状细胞癌发生发展的具体机制并提供相应的治疗策略十分重要。内质网是一种重要的细胞器，在蛋白质折叠和质量控制中起着至关重要的作用［3］。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是由内质网中未折叠或错误折叠蛋白质的不断积累所引起的，而未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）则可以减少转位到内质网内腔的蛋白质数量，增加内质网的转位和增强内质网的蛋白质折叠能力以保护细胞免受过于强烈的ERS 反应［4］。ERS 可以引起多种应激蛋白的表达上调，如葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）和葡萄糖调节蛋白94（glucose-regulated protein 94，GRP94）、钙结合伴侣凝集素calnexin 和Calreticulin以及底物特异性伴侣蛋白等［5］。ERS 蛋白在许多肿瘤类型中都有上调，包括结直肠癌［6］、乳腺癌［7］、肺癌［8］、肝癌［9］和前列腺癌［10］等。目前公认的ERS信号通路包括蛋白激酶R 样内质网激酶（protein kinase R -like endoplasmic reticulum kinase，PERK）-真核翻译起始因子2a（eukaryotic translation initia-tion factor 2a，eIF2a）-转录激活子4（activating tran-scription factor 4，ATF4）- C/EBP 同源蛋白（C/EBP homoiogousprotein，CHOP）、肌醇酶1（inositol-requir-ing enzyme 1，IRE1）-CHOP、转录激活子6（activat-ing transcription factor 6，ATF6）-CHOP 这3 条［11］。在口腔癌中，有文献报道其中一个ERS 相关蛋白calnexin 表达上调［12］。在大规模组织标本筛选发现舌鳞状细胞癌中calnexin 较癌旁组织高表达，而近期发现calnexin 可控制线粒体的位置和呼吸链反应［13］。结合本课题组前期在线粒体动力学的研究基础［14］，笔者通过干预ERS 蛋白calnexin 的表达以检测舌鳞状细胞癌细胞的生物学功能变化，包括细胞增殖、侵袭和迁移，以揭示calnexin 蛋白在舌鳞状细胞癌发生发展中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和设备

舌鳞状细胞癌细胞系SCC-9 和SCC-25 购自美国模式培养物集存库（American type culture collec-tion，ATCC）；DMEM-F12（Gibco，美国）；胎牛血清（BI，以色列）；calnexin 干扰序列和对照序列（苏州吉玛基因股份有限公司，中国）；RNA 提取试剂Trizol（Life Technologies，美国）；Lipofectamine 3 000（Invitrogen，美国）；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒和反转录试剂（TaKaRa，日本）；calnexin 和内参GAPDH 引物（苏州泓迅生物科技有限公司，中国）；蛋白酶抑制剂（Solarbio，中国）；RIPA 缓冲液（Sigma，美国）；calnexin 蛋白多克隆兔抗人抗体（Abcam，英国）；GAPDH 蛋白抗体、羊抗兔二抗（Proteintech，中国），CCK-8 试剂（Dojindo，日本），Transwell 小室及基质胶（Corning，美国）。实时荧光定量PCR 仪（LightCycler 480，Roche，德国）；WB曝光机（Mini Chemi 610，北京赛智创业科技有限公司，中国）；酶标仪（Multiskan MK3，苏州赛恩斯仪器有限公司，中国）；相机（BX63，Olympus，日本）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 用含10%胎牛血清的DMEM-F12 培养基培养细胞SCC-9 和SCC-25。培养条件：体积分数5% CO2，37 ℃，饱和湿度。隔天换液1 次，待细胞铺满瓶底时传代。按转染试剂盒说明对对数生长期细胞进行转染，分为calnexin 对照序列组（NC）和干扰组（si-CNX），其中实验证实si-CNX1 和si-CNX2 能够有效敲低calnexin 的表达，NC 和si-CNX 序列如下表1。

表1 Calnexin 对照序列和干扰序列Table 1 Calnexin control and interference sequences

1.2.2 采用qRT-PCR 检测calnexin 表达 各组细胞转染培养48 h 后，用细胞裂解液裂解，提取总RNA，并用紫外分光光度计检测总RNA 纯度。将总RNA 用试剂盒逆转录为cDNA，以引物序列为模板，用实时荧光定量PCR 仪扩增。引物序列如下表2。根据制造商的说明，qRT-PCR 是使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix（ReverTra Ace，Toyobo）和LightCycler 480（Roche，Basel，Switzer-land）进行的。对照组的相对表达水平设为1，各组样品设3 个复孔，采用2-△△Ct法对细胞中calnexin 表达量进行计算。

表2 qRT-PCR 引物序列Table 2 Sequences of the qRT-PCR primers

1.2.3 蛋白提取以及Western blot 实验 用PBS 冲洗细胞5 min，一共3 次。加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA 缓冲液。在4 ℃下将细胞溶解0.5 h，刮下样品并在4 ℃下以12 000 rpm 的速度离心20 min，收集上清液作为总蛋白。蛋白质提取物通过8%SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳转移到聚偏二氟乙烯膜，用抗人calnexin 抗体（浓度1∶2 000）、GAPDH 抗体（浓度1∶2 000），在4 ℃冰箱中孵育过夜，然后与过氧化物酶结合的二抗结合，通过化学发光观察条带，分析条带的灰度值。

1.2.4 细胞增殖实验 经过转染实验后，收集细胞并按10 000 个细胞/孔种入96 孔板中。所有的细胞都培养24 h 后使用CCK 8 试剂测定1、2、3、4、5 d的活细胞数。检测前去除每个孔的培养基，添加10 μL CCK 8和90 μL DMEM/F12的混合物，继续培养2.5 h后，用酶标仪测量A450 nm处的吸光度值。1.2.5 Transwell 法检测细胞迁移能力 各组细胞培养24 h 后进行转染实验，转染24 h 后，将溶于200 μL无血清培养基中的2×104个SCC-9 和SCC-25细胞分别接种于8 mm 直径的Transwell 小室中，24孔板下室加入含10% 胎牛血清的DMEM-F12 培养基，37 ℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱中恒温培养24 h。各小室用棉签去除细胞悬液，PBS 冲洗2 次，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色20 min，显微镜下随机挑选5个视野拍照计数穿膜细胞。

1.2.6 Transwell 法检测细胞侵袭能力 取基质胶，4 ℃解冻后用无血清培养液稀释，平铺于Transwell小室上室，过夜风干备用。其余步骤同1.2.5。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0 统计软件分析数据，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，P ＜0.05 差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 siRNA 干预calnexin 基因表达

qRT-PCR 检测发现，SCC-9 和SCC-25 细胞的干扰组si-CNX1 和si-CNX2 中calnexin mRNA 表达量较NC 组下调，差异有统计学意义（P＜0.001，图1a）。Western blot 结果也显示SCC-9 和SCC-25 细胞的干扰组si-CNX1 和si-CNX2 中calnexin 蛋白表达量下降（图1b）。

2.2 沉默calnexin 对细胞增殖能力的影响

与NC 组相比，si-CNX1 和si-CNX2 组SCC-9 细胞的增殖速度在第4 天减慢，差异有统计学意义（P ＜0.01），在第5 天增殖速度进一步减慢（图2a，P ＜0.001）；在SCC-25 细胞中si-CNX1 和si-CNX2 组增殖速度也是在第4 天（P ＜0.01）和第5 天较NC组减慢（图2b，P ＜0.001）。

2.3 沉默calnexin 对细胞侵袭和迁移能力的影响

与NC 组相比，si-CNX1 和si-CNX2 组SCC-9 细胞的侵袭和迁移能力减弱（图3a），差异有统计学意义（P ＜0.001）；同样，与NC 组相比，si-CNX1 和si-CNX2 组SCC-25 细胞的侵袭和迁移能力也减弱（图3b），差异有统计学意义（P ＜0.001）。

Figure 1 Expression of calnexin in tongue squamous cell carcinoma cells transfected with siRNA图1 Calnexin siRNA 转染舌鳞状细胞癌细胞后calnexin 的表达

Figure 2 Knockdown of calnexin inhibited the proliferation of tongue squamous cell carcinoma cells图2 沉默calnexin 基因能够抑制舌鳞状细胞癌细胞的增殖

3 讨 论

内质网是蛋白质合成的重要细胞器，功能包括跨膜和分泌性蛋白质折叠、脂质生物合成、药物解毒、钙储存和信号传导等。在稳定状态下，内质网蛋白折叠机制可以轻而易举满足肿瘤细胞的需求。然而，如果错误折叠的蛋白质积累超过可耐受的阈值，未折叠蛋白反应将被触发以提高内质网蛋白质折叠能力。如果未折叠蛋白反应调节失败，细胞将会走向凋亡［15］。内质网应激在肿瘤中普遍存在，与肿瘤进展和化疗耐药密切相关，耐受持续内质网应激的能力增强了肿瘤细胞的生存和发展。研究发现在舌鳞状细胞癌中同样存在内质网应激，且线粒体分裂在内质网应激中具有重要的调控作用［14］。近期又有学者发现内质网应激蛋白calnexin 可以控制线粒体位置和呼吸链反应［13］。在本研究中，沉默calnexin 的表达可抑制舌鳞状细胞癌的增殖、侵袭和迁移能力，揭示了内质网应激在舌鳞状细胞癌进展中具有关键作用。

钙是一种参与蛋白质修饰、蛋白质折叠、细胞存活和死亡信号传导等过程的常见信号分子，它储存在内质网中，在内质网中受到钙结合的内质网伴侣蛋白Calreticulin 和calnexin 的调节。calnex-in 是内质网上的I 型整合膜蛋白，具有辅助蛋白质折叠、监控内质网蛋白折叠质量和调节内质网应激等作用［16］。一项肺癌患者队列研究的结果提示calnexin 可能是肺癌血清诊断标志物［17］。此外，calnexin 蛋白水平可能成为5FU 化疗Ⅱ/Ⅲ期结直肠癌患者不良临床预后的一个新指标。体外研究进一步证实calnexin 对结直肠癌细胞生长增殖的重要性，也证明了下调calnexin 的表达可以提高结直肠癌对5FU 化疗的敏感性［18］。沉默calnexin 基因可显著抑制胃癌细胞的增殖和提高细胞凋亡率［19］。孙为增等［20］在肾母细胞瘤中的研究提示沉默calnexin 可促发内质网应激，通过激活JNK 通路从而促进肿瘤细胞的凋亡。用calnexin 中和抗体下调calnexin 的表达，发现肝癌细胞的增殖以及乳腺癌细胞和肝癌细胞的肺转移均被抑制［21］。因此，calnexin 可能通过调节内质网应激影响肿瘤细胞的生物学功能。

Figure 3 Knockdown of calnexin inhibited the invasion and migration of tongue squamous cell carcinoma cells图3 沉默calnexin 基因能够抑制舌鳞状细胞癌细胞的侵袭和迁移

研究者发现calnexin 在口腔鳞状细胞癌组织中的表达显著上调，而且calnexin 的高表达与口腔鳞癌患者预后不良呈正相关，其具体机制可能与免疫逃逸有关［12］。Alam 等［22］发现支架基质附着区结合蛋白1（scaffold matrix attachment region binding protein1，SMAR1）通过下调calnexin 促进肿瘤细胞表面主要组织相容性复合体1（major histocompati-bility complex 1，MHC I）的表达升高，抑制肿瘤的增长。然而，上述研究侧重于从免疫学角度探究calnexin 的功能和具体机制，并未揭示calnexin 的直接生物学功能。在本研究中，通过siRNA 敲低cal-nexin 的表达，并在mRNA 水平和蛋白水平证实了calnexin 的沉默效果。CCK8 实验结果提示下调calnexin 的表达能够抑制舌鳞状细胞癌细胞的增殖，Tranwell 实验则证实沉默calnexin 的表达能够显著抑制舌鳞状细胞癌细胞的侵袭和转移。cal-nexin 可能是舌鳞状细胞癌新的治疗靶点。

【Author contributions】 Zhong QJ performed the experiments，ana-lyzed the data，and wrote the article. Jin TT，Peng Y revised the arti-cle. Chen WX，Li JS designed the study. All authors read and ap-proved the final manuscript as submitted.