妊娠期糖尿病患者血浆中miR-197表达及与临床指标关系

刘红雪 韩 笑 张慕玲

南京医科大学附属淮安第一医院(223300)

妊娠期糖尿病(GDM)是常见妊娠并发症，但具体发病机制尚未明确[1]。微小型RNA(miRNA)广泛存在于真核生物中的非编码RNA，与靶基因mRNA序列特异性结合后，抑制靶基因的翻译或降解mRNA，参与细胞增殖、分化和凋亡等过程[2]。目前研究表明许多miRNA在GDM发生发展过程中发挥着不可忽视的作用[3-5]。Villard[4]等发现miR-197在Ⅱ型糖尿病低表达，但未见有证实miR-197作用的报道。本研究检测GDM患者血浆中miR-197的表达，并分析与血糖相关指标的相关性及其在GDM诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年1—6月在本院就诊的孕26周GDM患者84例、糖耐量正常孕妇84例和糖耐量异常孕妇50例。所有孕妇均为单胎初产妇、均排除妊娠前糖尿病，无肝、肾、高血压等疾病病史。本研究经本院医院伦理委员会批准，所有孕妇均签署知情同意书。

1.2 miR-197水平测定

孕妇禁食12h后采集10 ml静脉血离心，按照Trizol(美国Invitrogen公司)提取RNA，再按照One Step RT-qPCR Kit(上海生工生物工程股份有限公司)检测miR-197表达，以U6基因为内参。miR-197正向引物：5’-CCGACACGGCCATCTCTCC-3’，反向引物：5’-GGCCATGCTGGGTGGAGAAG-3’。U6正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。以待测miR-197与内参U6之间闭值循环数(Ct)之差(△Ct)表示相对表达量。

1.3 血糖和血清胰岛素水平测定

采用放射免疫法及葡萄糖氧化酶法检测各组空腹胰岛素(FINS)，其中血清胰岛素检测采用放射免疫试剂盒购自上海放射免疫分析技术研究公司；葡萄糖氧化酶法检测各组空腹葡萄糖(FPG)，测定试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司。应用稳态模型法计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR) =[FPG(mmol/L)×FINS(mIU/L)]/22.5。

1.4 统计学方法

采用SPSS19.0数据分析。数据以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验；采用Spearman相关分析，绘制受试者工作特征曲线(ROC)采用Z检验曲线下面积(AUC)。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 一般临床资料

GDM组患者，年龄(28.2±1.2)岁(22～37岁)，体质指数(BMI)(22.6±0.6)kg/m2(18～36 kg/m2)；正常组孕妇，年龄(28.2±1.4)岁(22～38岁)，BMI(22.8±0.7)kg/m2(18～35 kg/m2)；糖耐量异常组孕妇，年龄(28.3±1.4)岁(22～37岁)，BMI(23.0±0.8)kg/m2(18～35 kg/m2)。各组孕妇一般资料比较无差异 (P>0.05)。

2.2 miR-197表达差异

RT-qPCR检测结果表明，GDM组miR-197相对表达量(1.86±0.13)与正常孕妇组(7.02±0.44)和糖耐量异常组(4.595±0.20)比较明显降低(F=78.00，P<0.001)。见图1。

***各组间比较P<0.001)图1 各组孕妇miR-197表达比较

2.3 GDM患者血浆中miR-197表达与FINS、FPG、HOMA-IR关系

GDM组FPG(5.56±0.05)、FINS(15.46±0.07)、HOMA-IR(3.83±0.05)均高于正常孕妇组(FPG 4.21±0.04、FINS 10.52±0.06、HOMA-IR1.97±0.06)(t=193.20、491.10、218.30，均P=0.00)。Spearman相关分析结果表明，GDM组患者miR-197的表达与FPG、FINS、HOMA-IR均呈负相关(r=-0.862，-0.874，-0.939，P=0.01)，见图2。

图2 GDM组miR-197表达与FPG、FINS、HOMA-IR的相关性

2.4 GDM患者血浆中miR-197诊断GDM效能

GDM组血浆中miR-197诊断GDM的ROC曲线下面积为0.924(95% CI：0.890～0.957，P=0.00)，当取最佳截点(3.435)时，其灵敏度和特异性分别为79.1%和88.1%。

3 讨论

miR-197定位于染色体1p13.3基因组区域，在多种肿瘤中异常表达，发挥着抑癌和促癌的作用。 Ni[6]等研究表明，miR-197在肝癌组织中低表达，其表达水平与侵袭性临床病理特征相关，而与性别、年龄、病理分级、血清AFP水平无关。因此，miR-197可以作为早期诊断肝癌生物标志物。除此之外，杨咏[7]等研究表明子宫肌瘤患者外周血miR-197表达水平在一定程度上可反映子宫肌瘤大小、雌激素受体水平，且治疗后患者外周血miR-197水平明显升高，是患者病情及治疗的良好观察指标。提示miR-197有望成为该疾病早期诊断及预后判断的新的分子标志物。

GDM是最常见的妊娠并发症之一，虽然GDM诊断开始较早，但多数患者确诊时已是妊娠中期或晚期，而早期诊断非常重要。目前已有研究证实miRNA表达异常可在一定程度上反映机体的高糖、高脂状态[8]。Zamanian[8]等研究，通过Cytoscape V. 3.6.1进行交互网络分析，表达有差异的miRNA确定hsa-miR-145-5p和hsa-miR-875-5p为妊娠期糖尿病潜在的生物标志物。Chen[9]等研究表明miRNA-351通过抑制妊娠糖尿病小鼠的脂筏特征蛋白基因从而调控磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路减轻胰岛素抵抗和肝糖异生。本研究通过检测不同孕妇血浆中miR-197的表达量发现，GDM患者血浆中miR-197水平低于正常孕妇和糖耐量异常孕妇。提示miR-197可能与GDM的发病机制密切相关，推测原因是可能与miR-197参与调控GDM患者体内的炎症反应有关。该推测已在Cheng[10]等研究中被证实，他们认为，糖尿病患者持续的高糖环境会导致炎症和内皮细胞功能障碍，过表达miR-197可以抑制TLR4基因从而调控NF-κB/NLRP3通路减轻GDM患者体内的炎症反应。

本研究还分析发现，GDM患者血浆中miR-197水平与FPG、FINS、HOMA-IR呈负相关，与FINS无相关性。提示患者血浆中miR-197可能是导致GDM葡萄糖摄取障碍和胰岛素抵抗的分子机制之一。推测原因可能与miR-197负向调控胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)有关。已有研究表明，血浆中IGFBP-3在胰岛素抵抗和2型糖尿病患者中高表达，且与2型糖尿病患者代谢紊乱及并发症密切关联[11-12]。本研究中血清miR-197预测GDM的敏感度79.1%，特异度为88.1%，其ROC曲线下面积为0.924(95% CI：0.890～0.957)，提示miR-197有望作为GDM的潜在诊断指标，但这需要进一步扩大样本量及长期随访研究证实。