妊娠期免疫性血小板减少症患者血清miR-21、miR-155水平及与Th17/Treg平衡关系

徐 丹 孙海燕 董士业

浙江省绍兴第二医院医共体总院(312000)

免疫性血小板减少症(ITP)是一种获得性自身免疫性疾病，主要特征为外周血血小板减少、血小板破坏过多，妊娠期ITP患者存在血液科、产科、新生儿等各方面风险[1]。辅助性T细胞亚群17(Th17)与调节性T细胞(Treg)在机体炎症和免疫反应中发挥重要调节作用[2]。李姜惠子等[3]研究表明，Th17/Treg平衡在ITP中发挥重要作用。微小RNA(miRNA)可通过对免疫细胞分化和信号转导调控适应性免疫和固有免疫，miR-21、miR-155在多种疾病中均参与Th17/Treg细胞失衡[4-5]。但目前关于二者在妊娠期ITP中的关系报道较少。本研究通过检测妊娠期ITP患者miR-21、miR-155、Th17细胞、Treg细胞水平，探讨miR-21、miR-155与Th17/Treg细胞失衡的关系，以期为妊娠期ITP病情评估和预后提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年2月—2020年6月本院住院分娩的86例妊娠期ITP患者为研究对象(ITP组)，同期正常妊娠孕妇79例为正常组。纳入标准：①符合ITP诊断标准[6]，经实验室检查确诊者；②患病前6个月内未接受过免疫治疗、未有输血史且未发生过严重外伤者；③临床资料齐全者。排除标准：①伴有肝、肾、肺等脏器功能不全者；②伴有其他免疫系统疾病者；③既往有恶性肿瘤病史、风湿类疾病及精神异常者。本研究经本院临床研究伦理委员会批准，所有对象均自愿参加并签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

RNA提取试剂盒购自北京天漠科技开发有限公司；反转录试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司；miScript SYBR Green qPCR Kit购自德国QIAGEN公司；FITC标记的CD4抗体购自上海联迈生物工程有限公司；PE-IL-17A抗体购自美国Miltenyi公司；固定/破膜工作液购自美国Beckman公司；血清白介素(IL)-17、IL-10酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自美国GeneTex公司，IL-21、转化生长因子-β(TGF-β)ELISA试剂盒均购自杭州联科生物技术股份有限公司。实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3 研究方法

1.3.1样品采集及保存抽取所有对象清晨空腹静脉血，抗凝血采用密度梯度离心法获取单个核细胞，促凝血离心后分离血清，置-80℃保存待测。

1.3.2血清miR-21、miR-155检测采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测血清中miR-21、miR-155表达水平。采用RNA提取试剂盒提取血清总RNA，反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。采用qRT-PCR仪对miR-21、miR-155及其内参U6扩增，引物序列见表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。qRT-PCR反应体系共20μl：cDNA(50 ng/μl)2μl，miScript SYBR Green qPCR Mix 10 μl，上下游引物(10 μM)各0.8μl，ddH2O 6.4μl。反应条件：95℃预变性5min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，40个循环。每份样品均设3个重复孔，采用2-△△CT法计算血清miR-21、miR-155相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 Th17细胞、Treg细胞检测流式细胞术检测Th17细胞：PBS缓冲液冲洗2～3次单个核细胞，细胞浓度调整为1×106细胞/ml后放置于完全培养基上，加入2 ml白细胞活化混合物，37℃ 5%CO2培养箱中刺激5 h，PBS缓冲液冲洗2～3次，弃上清，加入FITC-CD4抗体后避光孵育30 min，加入固定/破膜工作液，30 min后加入PE-IL-17A抗体避光孵育30 min，加入PBS后1500 r/min离心5 min，弃除上清后加入少许PBS缓冲液重悬细胞，放入流式细胞仪检测。Th17细胞水平用CD4+IL-17+T细胞占CD4+T细胞百分比表示。Treg细胞检测：除加入固定/破膜工作液30 min后加入Foxp3-APC抗体避光孵育45 min外，其余步骤同上。Treg细胞水平用CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞百分比表示。计算Th17/Treg比值。

1.3.4血清炎性因子检测酶联免疫吸附法检测两组血清IL-10、IL-17、IL-21、TGF-β水平。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 两组基本情况及miR-21、miR-155水平比较

ITP组年龄(28.2±2.4)岁(25～35岁)，孕周(20.4±2.1)周；正常组年龄(29.3±2.4)岁(26～36岁)，孕周(20.6±2.3)周。两组年龄、孕周比较无差异(P>0.05)。ITP组miR-21(2.43±0.68)、miR-155(1.94±0.34)水平高于正常组(1.01±0.27、1.03±0.26)(t=17.344、19.186，P=0.000、0.000)。

2.2 两组Th17、Treg细胞水平比较

ITP组Th17细胞、Th17/Treg水平高于正常组，Treg细胞水平低于正常组(P<0.05)。见表2，图1。

表2 两组Th17、Treg细胞水平比较

A、B为Th17细胞(Q2区为Th17细胞所在区域)；C、D为Treg细胞(Q2区为Treg细胞所在区域)；A、C:正常组；B、D: ITP组 图1 Th17、Treg细胞流式细胞术检测图

2.3 两组血清炎性因子水平比较

ITP组IL-17、IL-21水平高于正常组，TGF-β、IL-10水平低于正常组(P<0.05)。见表3。

表3 两组血浆炎性因子水平比较

2.4 ITP组miR-21、miR-155与Th17/Treg及血清炎性因子水平相关性

Pearson法分析显示， ITP组miR-21、miR-155与Th17/Treg水平均呈正相关(r=0.538、0.526，P<0.05)。见图2；miR-21、miR-155、Th17/Treg水平与IL-17、IL-21水平呈正相关，与TGF-β、IL-10水平呈负相关(P<0.05)。见表4。

表4 ITP患者各指标水平相关性

图2 ITP患者miR-21、miR-155与Th17/Treg水平相关性

2.5 影响妊娠期ITP发生的多因素logistic回归分析

将是否发生妊娠期ITP作为因变量，以miR-21、miR-155、Th17/Treg、IL-10、IL-17、IL-21、TGF-β为自变量进行多因素logistic回归分析。结果显示，miR-21、miR-155、Th17/Treg是影响妊娠期ITP发生的独立危险因素(P<0.05)。见表5。

表5 影响妊娠期ITP发生的多因素logistic回归分析

3 讨论

ITP发病机制尚未完全清楚，一般认为与其机体体液免疫异常有关，主要表现为广泛性皮肤黏膜、内脏出血，危害患者生命健康[7]。妊娠期血小板减少有众多原因，如妊娠期急性脂肪肝、先兆子痫等妊娠期特有疾病可造成血小板减少，此外ITP引起的妊娠期孕妇血小板减少也较为常见[8]。妊娠期ITP常见于孕中晚期，轻度血小板减少，随着孕周进展而进行性加重，导致的出血风险严重威胁母婴预后[9]。

研究表明，T细胞介导的细胞毒性反应和免疫功能紊乱，T细胞亚群及其细胞因子在ITP的发病和疾病进展过程中发挥重要作用，而Treg细胞和Th17细胞均CD4+T细胞亚型中的重要细胞[10]。Th17细胞参与人体免疫反应，且在恶性肿瘤及炎症疾病的发病中发挥重要作用；Treg细胞可保持免疫系统对自身成分的耐受，从而使机体保持免疫稳态[11]。Treg细胞和Th17细胞紧密关联，Th17/Treg免疫平衡在正常免疫应答维持过程中发挥重要作用，且与ITP密切相关[12]。本研究发现，妊娠期ITP患者Th17细胞、Th17/Treg水平均高于正常孕妇，Treg细胞水平低于正常孕妇，且Th17/Treg是影响妊娠期ITP发生的独立危险因素。推测其可能是因为患者体内细胞免疫功能失调，导致T细胞分化的Th17细胞数量异常增多，Treg细胞减少，进而促进炎症细胞因子的分泌，导致炎症加深、机体免疫系统破坏，最终造成妊娠期ITP发生。

miR-21、miR-155在系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中发挥重要调控作用[13]。有研究表明[14]，miR-21、miR-155b表达水平与自身免疫性肝病患者外周血Th17/Treg细胞平衡有重要联系。本研究结果显示，妊娠期ITP患者miR-21、miR-155水平均高于正常孕妇，二者表达水平与Th17/Treg呈正相关，miR-21、miR-155均是影响妊娠期ITP发生的独立危险因素。推测miR-21、miR-155可能是通过高表达来影响Th17/Treg细胞平衡，增加机体免疫反应和炎症损伤，进而参与ITP的发生、发展。有研究表明，Treg细胞分泌的细胞因子TGF-β、IL-10有维持免疫耐受、抑制炎症反应等功能[15]；Th17细胞可通过其分泌的细胞因子IL-17、IL-21介导多种炎性细胞因子产生，扩大炎症效应[16]。而本研究发现，妊娠期ITP患者miR-21、miR-155、Th17/Treg水平与IL-17、IL-21水平呈正相关，与TGF-β、IL-10水平呈负相关。进一步提示miR-21、miR-155与TGF-β、IL-10、IL-17、IL-21等细胞因子水平及Th17/Treg细胞平衡均有关。

综上所述，妊娠期ITP患者血清中miR-21、miR-155、Treg细胞、Th17细胞均呈高表达，Th17/Treg处于失衡状态，患者miR-21、miR-155与Th17/Treg水平呈正相关。血清miR-21、miR-155高表达可能影响妊娠期ITP患者Th17/Treg免疫平衡状态。提示miR-21、miR-155有望成为评估妊娠期ITP的重要分子标志物及临床治疗的潜在靶点，但其具体分子作用机制有待进一步深入研究验证。且本研究并未探究不同孕周时血清miR-21、miR-155与Th17/Treg细胞失衡的关系，今后将纳入更多病例多时间点采血，进一步验证结果。