山西省及周边地区利什曼原虫SSU rRNA基因和ITS-1序列克隆及序列系统进化分析*

吴 云 安亦军 齐志群 李 威 田小军 吴赵勇 栗绍刚

(1.首都医科大学附属北京友谊医院热带医学研究所，北京 100050；2.北京热带病防治研究北京市重点实验室，北京 100050)

内脏利什曼病是由利什曼原虫寄生于人体引起的疾病，根据传染源不同，我国的内脏利什曼病主要分为人源型、犬源型和自然疫源型(张鹏等，2019)，人源型主要分布在苏北、皖南、鄂北、豫东、冀南、陕西关中和新疆南部等地区，患者为主要传染源；犬源型主要分布于甘肃、青海、宁夏、川北、陕北、冀东北、辽宁和北京市郊的山丘地区，病犬为主要传染源；自然疫源型主要分布于新疆以及内蒙等荒漠地区，某些野生动物为主要传染源 。随着国家对利什曼病的重视及控制，我国多数地区利什曼病已经得到控制，目前病例主要分布在新疆、四川、甘肃、陕西、山西、河南和内蒙古等地(郑灿军等，2017)。首都医科大学附属北京友谊医院就诊的内脏利什曼患者多数来自于山西及其交界的陕西、河北等地区，以往的研究显示山西省以婴儿利什曼原虫感染为主(Luetal.，1994；汪俊云等，1996)，近些年，随着人口流动性的增加，山西及周边地区感染内脏利什曼的虫种类型以及基因多样性是否有变化需要进一步的研究。

核糖体小亚基rRNA 基因(small subunit ribosomal rRNA, SSU rRNA)是真核生物一个较为保守的基因，在原虫的种间变异较大，可用于利什曼原虫种属之间亲缘关系的研究 (曹得萍等，2013)。核糖体的转录间隔区I(internal transcribed spacer I, ITS-1)是核糖体DNA中介于18 S-5.8 S之间的序列，该区域进化速度快，利什曼原虫种间表现出广泛的序列多态性，可用于利什曼原虫的分类鉴定(赵桂华等，2010；刘东立等，2018)。本研究使用PCR方法扩增来自山西及周边地区内脏利什曼病患者感染利什曼原虫的SSU rRNA 和ITS-1序列并测序，将测序结果与利什曼原虫不同种以及同一个种不同分离地的虫株的SSU rRNA 和ITS-1序列进行比对，并构建系统发育树以明确山西及周边地区感染的利什曼原虫虫种类型及遗传多样性特征。

1 材料与方法

1.1 一般资料

本项研究使用的13例内脏利什曼病患者的骨髓样本来自首都医科大学附属北京友谊医院2019年3月至2020年5月的住院患者,其中10例患者来自山西省(阳泉市7例、临汾市1例、平定县1例、山西省不能确定具体感染地1例)，3例患者来自周边地区(陕西渭南市1例、甘肃陇南市1例、河北邢台市1例)。构建系统发育树使用的利什曼原虫不同种以及同一个种不同来源地的SSU rRNA和ITS-1序列来自GenBank(表1)。

表1 利什曼原虫虫株及其国际编码和来源地Tab.1 Leishmania isolates and their international codes, isolated places

1.2 主要试剂和仪器

试剂：磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒(DP705,天根生化科技有限公司)；GoTaq Green Master Mix(M7123, Promega)。仪器：ProFlexTMPCR系统。

1.3 骨髓样本DNA提取

参照天根生化科技有限公司的DNA提取试剂盒(DP705)操作说明书提取。

1.4 SSU rRNA和ITS-1基因扩增、测序及同源性分析

扩增SSU rRNA使用的引物为R222(5′-TATTGGAGATTATGGAGCTG-3′)和R333(5′-AAAGCGGGCGCGCGGTGCTG-3′)(曾得萍等，2014)，PCR反应条件95℃2min；95℃30s，58℃30s，72℃15s，35个循环；72℃5min。扩增ITS-1使用的引物为LITSR(5′-CTGGATCATTTTCCGATG-3′)和L5.8S(5′-TGATACCACTTATCGCAC-3′)(赵桂华等，2010)。PCR扩增反应条件95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，40 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，35个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物送至生工生物工程股份有限公司双向测序，测序结果使用ContigExpress软件进行拼接，使用MegAlign软件进行同源性分析。

表1续 Tab.l Continued

1.5 系统发育树构建

使用本研究测序得到的13条SSU rRNA和13条ITS-1序列与GenBank下载的利什曼原虫不同种以及同一个种不同地区分离到的利什曼原虫的SSU rRNA基因序列(29条)和ITS-1基因序列(28条)，应用MEGA 7.0 软件中的Clustal W 法对全部序列进行比对，使用neighbor-joining 方法构建系统进化树，采用Bootstraping 法对进化树进行评估。

2 结果

2.1 SSUrRNA和ITS-1基因序列比对结果

13个样品的SSU rRNA和ITS-1序列同源性分别为99.59%(图1)和99.93%(图2)。将本研究的13条SSU rRNA基因序列以及GenBank下载的29条序列比对，同源性为85.8%～100%(图3)；13条ITS-1序列以及GenBank下载的28条序列比对，同源性为66.2%～100%(图4)。该结果表明ITS-1序列在利什曼原虫种间以及种内虫株间变异度较SSU rRNA基因大，利什曼原虫的SSU rRNA基因相对更保守。

图1 13例患者感染利什曼原虫虫株SSU rRNA基因的序列比对结果Fig.1 Sequence alignment of SSU rRNA gene of 13 patients infected with Leishmania strain

图2 13例患者感染利什曼原虫虫株ITS-1序列比对结果Fig.2 Sequence alignment of ITS-1 sequences of 13 patients infected with Leishmania strain

图3 利什曼原虫SSU rRNA序列同源性比较Fig.3 Homology of SSU rRNA genes of Leishmania

图4 利什曼原虫ITS-1序列同源性比较Fig.4 Homology of ITS-1 sequences of Leishmania

2.2 基于SSU rRNA基因和ITS-1序列分别构建系统发育树

基于SSU rRNA基因构建系统发育树(图5)，结果显示，13株患者感染虫株亲缘关系较近，均聚到一个分支上，并与杜氏利什曼L.donovani、婴儿利什曼L.infantum和恰氏利什曼L.chagasi聚到一个分支上，但不能更进一步确定为哪一个虫种。基于ITS-1序列构建系统发育树(图6)，13株患者感染虫株均聚到一个分支上，与L.infantum聚到一个分支上，表明13株患者感染虫株均为L.infantum。

本研究在引入外群基因时纳入了同时具有SSU rRNA基因和ITS-1序列的10个虫株，通过分析比较这10个虫株以及本研究使用的13个临床样本的序列，我们发现本研究使用的13个样本不论是使用SSU rRNA基因还是ITS-1序列，都与甘肃分离到的原虫株MHOM/CN/93/GS7聚到一起(图5，6)。MHOM/CN/80/XJ801(新疆)、MHOM/CN/83/GS2(甘肃)、MHOM/CN/90/SC10H2(四川)、MHOM/CN/84/SD1(山东)4个虫株基于SSU rRNA基因构建系统发育树，聚到一个小分支上；而基于ITS-1基因构建的系统发育树，4个虫株聚到一个相对大的分支上，大分支下又进一步细分，MHOM/CN/83/GS2(甘肃)和MHOM/CN/84/SD1(山东)在一个分支上，表明亲缘关系更近。MHOM/CN/80/XJ801(新疆)和MHOM/CN/90/SC10H2(四川)聚到一个分支上。因此，基于SSU rRNA基因进行系统发育树的构建可以按照亲缘关系远近分成大类，却不能有效的区分不同的虫种(图5)，使用ITS-1基因聚类可以进行不同种的有效区分，并且可以进一步在种内进行区分(图6)。

图6 基于ITS-1序列构建系统发育树Fig.6 Construction of phylogenetic tree based on ITS-1 sequences

3 讨论

山西省目前仍然是我国内脏利什曼病的流行区，我院诊断的黑热病有75%来自山西，以往的文献报道山西省利什曼原虫感染患者多为犬源型，以婴儿利什曼原虫为主。随着近些年人口流动性的增加，山西感染的利什曼原虫的虫株是否有变化以及其基因的多态性有待于进一步研究。

本研究以我院收治的13例来自山西以及周边地区的内脏利什曼患者感染虫株的SSU rRNA和ITS-1序列进行了测序并比对，13个患者感染虫株的SSU rRNA基因同源性达到了99.59%，ITS-1序列同源性为99.93%，表明13个患者感染虫株同源性很高，感染虫株可能为同一个种。为了进一步验证，从GenBank下载了利什曼原虫不同种以及同一个种不同虫株的SSU rRNA和ITS-1序列，基于SSU rRNA和ITS-1序列分别构建了系统发育树，结果显示，不论使用SSU rRNA基因还是ITS-1基因，13个内脏利什曼的感染虫株均聚到一个分支上，因此，13个患者的感染虫株属于同一个种。基于SSU rRNA基因的聚类图显示13个患者的感染虫株与杜氏利什曼原虫，婴儿利什曼原虫和恰氏利什曼原虫聚为一类(图5)。L.infantum属于L.donovani的亚种，亲缘关系较近，使用SSU rRNA基因进行分类L.infantum和L.donovani出现在同一个分支上的，并不能进一步区分，因此，我们的研究结果也支持SSU rRNA基因更适用于高阶元的系统发育研究这一结论(曹得萍等，2013)。

图5 基于SSU rRNA基因构建系统发育树Fig.5 Construction of phylogenetic tree based on SSU rRNA gene sequences

目前报道的可用于利什曼虫种鉴定的序列有ITS序列(Charguietal.，2012)，细胞色素氧化酶基因(cytochrome-b gene，Cyt-b)(Hideetal.,2008)，表面糖蛋白63基因(Glycoprotein 63, GP63)(Victoiretal.，1998)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)(Castilhoetal.，2003)，热休克蛋白(heat shock protein, Hsp)(Fragaetal.，2013)等。本研究使用ITS-1序列进行利什曼原虫虫种的鉴定，结果显示ITS-1序列可有效的区分亲缘关系较近的婴儿利什曼原虫和杜氏利什曼原虫，可进行亚种水平的鉴定，与报道的研究结论一致(刘东立等，2018；程芳洲等，2019)。此外，本研究引入了10个虫株同时具有SSU rRNA和ITS-1序列，通过分析发现SSU rRNA基因和ITS-1序列对这10个虫株的分类结果是一致的，本研究通过保守性更好的SSU rRNA基因进一步验证了ITS-1序列分类的准确性。研究的结果提示我国山西省内脏利什曼病患者感染虫种以婴儿利什曼原虫L.infantum为主，与以往文献报道的结论一致(Luetal.，1994；汪俊云等，1996)，并且不同患者感染虫株的SSU rRNA基因和ITS-1序列同源性很高，感染虫株遗传关系较近。