复方中草药对罗氏沼虾碱性磷酸酶（AKP）和血清蛋白的影响

洪迪珊，王余德

（湖南师范大学生命科学学院，省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室，长沙 410081）

罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）属节肢动物门（Arthropod）、甲壳纲（Crustacea）、十足目（Decapoda）、长臂虾科（Palaemonidae）、沼虾属（Macrobrachium），是一类大型淡水经济虾，原产于东南亚（主要是马来西亚），素有淡水虾王之称，被引进到世界各地，成为世界养殖产量最高的三大虾种之一［1］。罗氏沼虾具有生长快、个体大、食性广、生长周期短、易饲养等优点，是一种理想的养殖品种，且营养丰富（可食部分蛋白质含量为20.5%）、味道鲜美，是广受国际水产品市场和世界虾类养殖业者喜爱的养殖水产品。但是，随着罗氏沼虾的推广逐步走向集约化养殖，人们在追求产量的同时却降低了对其种质的要求。这一现象主要体现为育苗亲本的选育不严格、虾苗营养供给不足等。除此以外，在养殖过程中大量使用抗生素及化学药物的现象时有发生，致使某些病原微生物的耐药性增强，其抗病力强的特点已经不复存在。白浊病（whitish muscle disease）、桃拉病毒（Taura syndrome virus）和传染性及皮下造血组织坏死病毒（infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus）对罗氏沼虾养殖业造成了严重影响。加上环境污染等原因，使得水产养殖业的经济损失巨大［2］。随着人们生活水平的提高，国内外对水产品质量的要求逐年提高，抗生素及化学药物将受到严格限制，因此，提高机体自身的免疫力是解决病害问题的关键，加紧关于复方中草药对提高罗氏沼虾免疫力的研究是有必要的。

中草药源于天然并保持了它们的自然结构和生物活性，是动物体最易接纳的纯天然物质。其主要活性物质如多糖、甙类、生物碱、黄酮类等通过对动物机体免疫系统的刺激而呈现较为典型的非特异性免疫和特异性免疫作用［3］。除了含有免疫物质外，中草药还含有一些未知的促进生长活性的因子及一定量的蛋白质、氨基酸、糖类、矿物质、维生素、脂肪等营养物质，这些成分可以增强食欲、促进机体代谢和消化酶的分泌，有利于提高营养物质的利用率，从而加速水产动物的生长发育，降低饲料系数，增强水产动物体质，进而提高机体的免疫力和抗应激能力［4］。研究表明，中草药制剂在防病、抗病和抑菌方面有着独特的功效［5-8］，而选择多种具有不同药理作用的中草药组成复方中草药制剂可以得到药效互补、疗效增强的效果。作为一种饲料添加剂，中草药制剂具有增强家禽免疫力、提高家禽生产性能、防病治病等功能。其与传统抗生素添加剂相比，有着来源广泛、生产成本低、不易产生耐药性和不易残留的优势［9］。本试验探讨了饲料中按质量比1∶1∶1∶1添加黄芪（Astragalus mongholicus）、板蓝根（Isatidis radix）、杜仲（Eucommia ulmoides）、鱼腥草（Cordate houttuynia）制成的复方中草药制剂对罗氏沼虾的生长性能和免疫活性产生的影响，为罗氏沼虾的生态健康养殖提供保障。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的罗氏沼虾于2018 年7 月取自长沙市大成桥镇鹊山村罗氏沼虾养殖场 （胜虾场）。虾苗个体大小均匀，活力强，肠胃饱满。在静止状态下，大部分虾苗呈伏底状态，受到水流刺激后有顶水现象。取回后饲养于湖南生物研究所露天平台上，试验用水箱规格为内径80 cm、高100 cm 的圆形黑色水箱。于每个水箱取5尾虾称重、测体长，求其平均值并记录数据。养虾用水需要事先将自来水存于干净水箱中曝气1～2 d，并调节自来水的软硬度（于每桶水中加入0.4 g Na2S2O3、2.0 g葡萄糖、3.0 g NaOH），注意调节水的pH在7～8，水温控制在20～30℃（若水温低于16℃，罗氏沼虾易大量死亡）。

1.2 试验设计

试验设置对照组C K（0%）及A（1.0%）、B（1.5%）、C（2.0%）、D（2.5%）、E（3.0%） 5个质量分数梯度，每个质量分数梯度分组中各有25 只罗氏沼虾，分别饲喂于6 个水箱中（表1）。在基础饲料中分别添加不同质量分数的复方中草药制剂，采用连续投喂的方法饲喂罗氏沼虾25 d，提取罗氏沼虾心脏血清检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、溶菌酶及蛋白含量，与对照组作对比，并得出最佳中草药的质量分数。

1.3 复方中草药制剂

本试验选取黄芪、板蓝根、杜仲、鱼腥草4 味中草药按质量比为1:1:1:1 配成复方中草药制剂。将中草药制剂粉碎后进行浸泡处理，以方便复方中草药制剂与饲料较为准确地按照质量分数梯度混合。试验梯度：试验饲料中分别添加质量分数为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的复方中草药制剂，对照组饲料中不添加。

每个质量分数梯度分组的虾每天需喂养10 g试验饲料（日投喂量为体重的4%～10%）。将复方中草药制剂与饲料混匀后投喂给罗氏沼虾，配方如表1。

表1 添加复方中草药制剂配方表Tab. 1 Formula for compound Chinese herbal medicine unit: g

1.4 饲养管理

采用定时定量投喂的方式，并根据摄食和生长情况作相应的调整，每天在08:00、12:00、17:00、21:00 时投喂，早晚2 次的投喂量为总投喂量的60%～70%。每天早晚用温度计测量水温，确保在20℃以上（20～30℃），并且测量水环境的pH 值，使之维持在7～8。每天换1次水（调节过pH、软硬度、渗透压、曝气2 d 的贮备水），且换水时只可放出1/3的水，否则水环境会改变（以微微发绿，有藻类及浮游生物的水质为佳）。空压泵不间断充气和增氧，室外自然光照。每天进行排污，发现死虾及时捞起，称重并做记录。每天观察罗氏沼虾摄食（罗氏沼虾腹部肠道呈黑色，饱满）、蜕壳及生长情况。健康的罗氏沼虾体色透明，有活力，遇水流刺激会弹开。

1.5 采样及生长性能指标的测定

1.5.1 体长及体重

试验结束后，于每个质量分数梯度桶中取5 尾虾，分别用电子天平称其体重，用游标卡尺测体长，求其平均值、体长增长率和相对增重率，并记录下数据。其体长增长率、相对增重率、特定生长率和饵料系数的计算公式如下：

体长增长率（%）=（试验末体长－试验初体长）/试验初体长×100%；

相对增重率（%）= （试验末体重－试验初体重）/试验初体重×100%；

特定生长率（%/d）=（lnWt－lnWo）/t×100%；饲料系数=摄食量/（Wt－Wo）。

Wt为试验末虾体均重（g）；Wo为试验初虾体均重（g）；t为试验时间（d）。

1.5.2 罗氏沼虾心脏血清的提取

每个质量分数梯度桶重复取10 尾虾，逐尾用5 mL 注射器自罗氏沼虾头胸甲后插入心脏取血，合并置于Eppendor 管，于冰箱4℃中保存。以5 000 r/min 离心10 min，收集血清，-70℃下保存待测。

1.6 罗氏沼虾血清免疫指标的测定方法

1.6.1 AKP 的活力测定

参照宋善俊等［10］的方法，使用磷酸苯二钠比色法测定血清碱性磷酸酶，见表2。

表2 AKP活力测定操作表Tab. 2 Operating table for determination of AKP activity unit: μL

1.6.2 血清及组织匀浆中的蛋白测定

均匀切取1 块罗氏沼虾的腹肌组织，准确称取其重量，按重量体积比［11］加生理盐水制备成10%的组织匀浆，1 000～3 000 r/min 离心10 min，然后取组织匀浆上清，再用生理盐水按1:9 稀释成1% 的组织匀浆待测。测定管分血清组及组织匀浆组，每组6 个质量分数梯度（含对照组），并且设3 组平行试验（表3）。蛋白含量（g/L）=［（测定管OD值-空白管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）］ ×标准管浓度（0.563 g/L），其中OD为光密度。

表3 血清及组织匀浆中蛋白测定Tab. 3 Determination of protein in serum and tissue homogenate unit: mL

1.6.3 数据统计方法

采用 Microsoft Excel 2010 软件对试验数据进行方差分析，数据用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 复方中草药对罗氏沼虾生长的影响

由表4 和图1 可以看出，罗氏沼虾的特定生长率（specific growth rate，SGR）、体长增长率（growth rate of body length，LG）、相对增重率（relative weight gain rate，WG）3 项指标随着饲料中复方中草药制剂质量分数的增加呈现先上升后下降的趋势，与对照组相比，试验组3 项指标有明显提高。饲料系数（food coefficient，FCR）与对照组相比差异不明显，但依然呈现先缓慢下降后上升的趋势。当复方中草药制剂的质量分数增加到2.5%时，3 项指标达到最高，FCR 达到最低（说明饲料转化率提高），当质量分数增加到3.0%时，3 项指标均有所降低，FCR有所升高（说明饲料转化率降低）。当复方中草药制剂的质量分数分别为1.0%、1.5%、2.0% 时，各项指标差异不明显。这表明当饲料中复方中草药制剂的质量分数为2.5% 时，罗氏沼虾的生长性能最好。

表4 复方中草药制剂的质量分数对罗氏沼虾生长的影响Tab. 4 Effects of compound Chinese herbal medicine mass fraction on growth in Macrobrachium rosenbergii

2.2 复方中草药对罗氏沼虾血清中免疫指标的影响

表4、5 表明，随着复方中草药制剂质量分数的提高，罗氏沼虾血清中的AKP 活性（图2）以及蛋白含量（图3）均呈现先上升后下降的趋势。当中草药的质量分数达到2.5% 时，AKP 的活性达到最大值，蛋白含量达到最高。当中草药的质量分数达到3.0% 时，罗氏沼虾血清中的AKP 活性及蛋白含量较D 组（2.5%）明显下降，但仍高于A 组（1.0%） 。这表明当饲料中所添加的复方中草药制剂的质量分数为2.5% 时，罗氏沼虾血清中的AKP 活性最高，蛋白含量最大。

表5 各复方中草药质量分数梯度分组血清中AKP及蛋白含量Tab. 5 The AKP and protein activity of the compound Chinese herbal medicine mass fraction gradient grouping in Macrobrachium rosenbergii

2.3 复方中草药对罗氏沼虾肌肉中蛋白含量的影响

以中草药质量分数梯度为横坐标、蛋白含量为纵坐标作曲线图，罗氏沼虾腹肌中蛋白含量为血清中蛋白含量下方一条平滑的曲线（图4）。由图4可以看出，复方中草药对罗氏沼虾肌肉中蛋白含量的影响没有血清中蛋白含量的明显，但仍然呈现缓慢上升后下降的趋势。当中草药的质量分数达到2.5%时，罗氏沼虾腹肌中蛋白含量达到最大值。这表明当复方中草药制剂的质量分数为2.5% 时，罗氏沼虾的免疫力最强，对非特异性免疫活性有明显的促进作用，并且有助于提高罗氏沼虾的营养价值，如表6。

表6 各复方中草药质量分数梯度罗氏沼虾肌肉中的蛋白含量Tab. 6 The protein concentration of the compound Chinese herbal medicine mass fraction gradient grouping in Macrobrachium rosenbergii

图1 复方中草药制剂的质量分数对罗氏沼虾生长的影响Fig. 1 Effects of compound Chinese herbal medicine mass fraction on growth in Macrobrachium rosenbergii

图2 复方中草药制剂的质量分数对罗氏沼虾血清中AKP的影响Fig. 2 Effects of compound Chinese herbal medicine mass fraction on the AKP in Macrobrachium rosenbergii

图3 复方中草药制剂的质量分数对罗氏沼虾血清中蛋白活性的影响Fig. 3 Effects of compound Chinese herbal medicine mass fraction on the protein activity in Macrobrachium rosenbergii

图4 复方中草药制剂的质量分数对罗氏沼虾肌肉和血清中蛋白含量的影响Fig. 4 Effects of compound Chinese herbal medicine mass fraction on Macrobrachium rosenbergii muscle and serum protein concentration

3 讨论

中草药添加剂取自自然界，其成分具有自然的结构状态，保持天然性外源精华，同时具有生物活性和双向调节等优势，毒副作用不明显，不污染环境，抗药性小。黄芪、板蓝根、杜仲、鱼腥草4 味中草药含有多糖、甙类、黄酮、氨基酸等多种有效成分，具有促进免疫增强和双向免疫调节的作用［12］。本试验证明了富含这些成分的复方中草药添加剂可明显提高罗氏沼虾的免疫活性。王雷等［13］利用富含上述免疫活性成分的数种中草药物制成的饲料对中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）进行投喂，发现中国对虾的发病率和死亡率明显降低，体内的抗菌、溶菌活力等免疫指标均有所提高。

罗氏沼虾属于无脊椎动物，且其体液不具有免疫球蛋白，其主要通过非特异免疫系统和非特异免疫因子的调节来抵抗病原体的袭击［14］。本试验发现，随着饲料中复方中草药质量分数的提高，罗氏沼虾的血清中AKP 活性、蛋白含量呈现先上升后下降的趋势，试验组相较于对照组有很大提高，在各试验组中2.5%的添加量效果最好。本试验还发现复方中草药添加剂可明显促进罗氏沼虾的生长。当中草药制剂的质量分数达到1.0%时，LG、WG及SGR 均有明显提高。随着中草药质量分数的增加，3 项指标均呈现先上升后下降的趋势，当中草药的质量分数达到2.5%时，各项指标均达到最大值，并在提高到3.0% 时明显下降，但仍然高于A 组（1.0%）。FCR 与对照组相比差异不明显（P＞0.05），但依然呈现先缓慢下降后上升的趋势。当复方中草药制剂的质量分数增加到2.5%时，FCR 达到最低值（说明饲料转化率提高），当增加到3.0%时，FCR有所升高（饲料转化率降低）。结果表明，当饲料中复方中草药制剂的质量分数为2.5%时，罗氏沼虾的生长性能最高。这与已有的一些研究结果一致［15-17］。由此可以推测，复方中草药制剂对罗氏沼虾的促生长作用可能与其提高饲料营养物质消化利用率和改善消化道内环境有关。

由试验可知，复方中草药制剂对罗氏沼虾蛋白含量的影响在肌肉和血清中差异明显。这一结果与周遵春等［18］研究结果一致，证实了复方中草药制剂对罗氏沼虾蛋白含量具有促进作用，可推测出现这一现象可能与复方中草药黄芪等属于双向免疫调节剂（对免疫功能低下者起促进作用，而对免疫机能亢进者起抑制作用［19］）有关，具体机制尚有待进一步试验予以证实。

综上所述，本试验选取黄芪、板蓝根、杜仲、鱼腥草4 味中草药按质量比为1∶1∶1∶1 配成的复方中草药制剂能够显著提高罗氏沼虾的生长速度，增强AKP 活性，提高罗氏沼虾体内的蛋白含量。进而说明复方中草药制剂作为罗氏沼虾饲料添加剂能够显著提高罗氏沼虾的生长性能和免疫力，可有效保障罗氏沼虾的健康和养殖经济效益，可在罗氏沼虾养殖生产中推广应用。