检疫性有害生物枣咔实蝇的快速分子鉴定*

陈光辉 李 焱 张小菊 胡红英

(1. 喀什大学生命与地理科学学院，新疆喀什 844000；2. 新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室，新疆喀什 844000；3. 新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐 830046；4.喀什海关技术中心，新疆喀什 844000 ；5.乌鲁木齐海关技术中心，新疆乌鲁木齐 830000)

红枣的维生素含量非常高，具有滋阴补阳的功效，是天然的维生素，枣果甘甜可口，深受人们的喜爱。红枣树为温带作物，适应性强，具有耐旱、耐涝的特性，在我国广泛种植，果实尤其以新疆红枣最为甘甜。然而，研究表明枣咔实蝇CarpomyavesuvianaCosta对枣果危害严重，给红枣产业带来毁灭性打击。枣咔实蝇是非常危险的重大检疫性有害生物、在新疆乃至全国枣产业上有着重要经济意义的害虫，该虫在2007年被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》(吴恂等，2007；张润志等，2007；阿地力·沙塔尔等，2008)。

枣咔实蝇隶属于双翅目(Diptera)、实蝇科(Tephritidae)、实蝇亚科(Trypetinae)、实蝇族(Trypetini)、咔实蝇属Carpomya(张润志等，2007)。该虫已经分布于印度、巴基斯坦、毛里求斯、阿富汗、泰国、乌兹别克斯坦、塔吉克斯坦、土库曼斯坦、伊朗、俄罗斯、阿曼等国(Gyietal.，2003； Azametal.，2004；Farraretal.，2004；Sookaretal.，2006；阿地力·沙塔尔等，2008；胡陇生，2012)。该虫主要以卵和幼虫随寄主果实、蛹随土壤、苗木的调运传播，主要危害枣属的植物，如红枣Ziziphusjujuba和酸枣Z．jujubavar．spinosa(Hancocketal.，1994；Farraretal.，2004)；成虫将卵产于红枣果实表面致使产卵部位果肉组织发育滞缓而形成缺陷，果面可形成斑点和虫孔；幼虫蛀食枣果内部果肉并形成蛀道导致枣果早熟和腐烂，不蛀食枣核和种仁；枣果被害率可高达60%～70%以上，产量损失可达20%以上，严重时枣果绝收(阿地力·沙塔尔等，2008)，给世界多地红枣产业造成重大损失(Lakraetal.，1983；陈乃中，1998；Dashadetal.，1999；Stonehouseetal.，2002；Gyietal.，2003a)。阿地力·沙塔尔等(2008)首次报道了该虫在我国新疆吐鲁番地区的发生情况，与本文研究为同种但传播来源不同；目前已对枣咔实蝇生物生态学特性、产卵选择性及适生性进行研究(何善勇等，2009；胡陇生等，2012)。由于该虫主要以幼虫形式钻蛀在枣果内取食，成虫善于飞行，防治较为困难；化学农药在一定程度上能够起到防治效果(Singhetal.，2000；Gyietal.，2003a,b)，但不能根除，不是长久之计。因此，加强检验监管，加强监测早期预警，阻止该虫传播扩散是减少经济损失的有效方法。

枣咔实蝇的快速准确鉴定是监测预警防控的基础，在口岸一线及果园检测预警对该虫实现快速鉴定是减少和降低该虫入侵风险和危害的重要屏障。目前，对于枣咔实蝇的鉴定依赖于的形态特征，该虫的蛹、成虫近似种样本均很难辨认，不能快速实现准确鉴定，严重影响预测预警和后期防治，以分子生物学技术为基础的DNA条形码技术能够解决此类问题(马英等，2012)。

物种DNA分子鉴定是由Tautz等(2002)、Hebert等(2003a,b)和Ward等(2005)提出，利用DNA序列的保守性和变异性对多个物种进行了分类鉴定。利用分子生物学手段，结合生物信息学分析和信息提交等步骤(杨倩倩等，2012；陈光辉等，2018)，发现具有足够变异的标准化短基因片段(兼具保守性和变异性)来区分物种(刘慎思，2012)。目前在昆虫线粒体基因中，常选用COI、COII、16SRNA鉴定物种(郭玉燕等，2017)，多数物种的COI序列的种内遗传距离大多小于2%，而种间遗传差异相对较高(Hebertetal.，2003；Wardetal.，2005；Folmeretal.，2006; Hajibabaeietal.，2006；张媛等，2011)，能够广泛用于动物种及种群研究。由于ITS2等序列选择压力小，变异较大，种内遗传差异相对其他基因较高，适合物种及其种群的研究(黄华平等，2006)。关于枣咔实蝇DNA条形码基因发掘较少，有待进一步丰富。

在DNA条形码鉴定时，经常出现某个基因扩增不出的情况，对多个条形码进行研究，实现快速鉴定非常有必要。本研究旨在对枣咔实蝇进行DNA条形码研究，克服传统形态分类学鉴定方法存在的不足，充分挖掘枣咔实蝇多个分子鉴定靶点，获得相关基因分子数据，作为形态学特征的补充，实现不同样品状态的快速鉴定，为该虫快速鉴定、早期防治提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 主要设备

体视显微镜(Motic Cam2506 SMZ168)、 PCR 仪(Biometra TProfessional standard Gradient Thermocycler)、高速低温离心机(Beckman CoulterTMAllegraTMX-22R Centrifuge)、制冰机(SANYO Ice Maker SIM-F140AY65)、电泳仪(JY1600C)、水平电泳槽(美国 Bio-Rad)、凝胶成像仪(BioRad Molecular Imager Gel Doc XR+凝胶成像系统)、振荡器(IKA MS3 digital)和恒温水浴锅等。

1.2 标本采集和保存

2018年7～8月从喀什海关旅客携带物中截获该虫标本。将蛹至于含有潮湿沙土的50 mL离心管中，纱布用皮筋箍紧离心管口，在室温下将蛹孵化并收集成虫。观察蛹和成虫样品外观形态。将该虫蛹和成虫整理后保存于含有99%酒精的离心管中，并放置于冰箱4 ℃冷藏保存，做为DNA提取材料。

1.3 基因组 DNA 提取和PCR 扩增

1.3.1基因组 DNA 的提取：样品DNA采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取，具体操作步骤见试剂盒(Cat.#DP304-02, RT(15-20 ℃))说明书。

1.3.2基因片段PCR 扩增：引物由上海生工合成，具体引物序列及参考文献如表1所示。扩增体系总体积为25 μL，包括1.5 U Taq酶，0.25 mmol/L dNTP，1×反应缓冲液，2.0 mmol/L Mg2+，上下游引物各为通用引物0.3 μmol/L，DNA 模板50 ng。反应程序为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 45 s，45(55)℃退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，循环 40次；最后 72 ℃延伸 7 min。PCR产物送至安徽通用生物技术公司进行测序(双脱氧法)。

表1 PCR 扩增引物及其参考文献Tab.1 PCR primer designed and the reference cited

1.4 序列数据处理及分子系统树构建

用 Dnastar Package 中的Editseq软件进行正反链拼接匹配校正测序获得的基因序列。在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上运行 BLAST程序进行序列相似性比较，确定所获得的序列是否是昆虫的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII基因序列。根据相似度和种内遗传距离对样品进行分子鉴定。结合从GenBank 中比对的与所获得的ITS2、12SrRNA、16SrRNA、CYT-B-D、COI-5′、COI-3′、COII序列相似性较高的该虫的相关序列，用ClustalX1.83软件比对，非保守区域去除。用分子进化遗传分析软件MEGA6.0(Kumaretal.，2004；金倩等，2013)分析各物种间DNA序列的差异，基于 Kimura-2-Parameter模型，用邻近法(NJ, Neighbour-Jioning)构建分子系统树，系统树各分支以1 000次循环估计系统树中节点的自举置信水平(Bootstrap confidence level，BCL)的重复检验(褚栋等，2005; 林丽莉等，2010)。

2 结果

2.1 枣咔实蝇形态学鉴定

枣咔实蝇的分类地位已经明确，属于完全变态昆虫，可分为卵、幼虫、蛹、成虫4个发育形态，其形态特征如表2所示。

表2 枣咔实蝇形态特征Tab.2 Morphological characteristics of Carpomya vesuviana

2.2 分子鉴定结果

测序获得了该虫蛹和成虫样品ITS2、12SrRNA、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII基因的部分序列，依据表3中在NCBI数据库中查阅的相关序列的覆盖度、相似度最高的GenBank No.等信息进行鉴定。覆盖度较低，且序列相似度低于种内遗传距离的补数时，确定为新的条形码序列；表明数据库中未检索到相关相似序列，核酸序列与NCBI数据库中的相关序列相似度较低，确定为该虫样品的新序列。本文获得的枣咔实蝇核酸序列较多，共获得16条，其中COI-5′基因2条为已有报道的鉴定序列，在BOLD中被鉴定为：枣咔实蝇Carpomyavesuviana，BIN ID:BOLD:ACH5208；其余14条在NCBI中未能鉴定出，为未见报道的新序列。

表3 NCBI比对结果Tab.3 NCBI Blast results

2.3 ITS1、ITS2、CYT-B、COI碱基含量统计

将所测序列进行拼接校对，在NCBI 网站上运行BLAST 程序可以确定测得序列为昆虫的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII基因序列。通过与 GenBank中的相关序列进行比较，结合 GenBank 中下载的与该相应序列相似性较高的枣咔实蝇的序列，用 ClustalX1.83 软件进行比对，将非保守区域去除，测序拼接后仅以表4中的序列长度进行分析。通过DNAman软件分析本文所获得的各个基因序列所有位点中AT碱基含量和GC碱基含量如表4所示。序列碱基含量统计分析结果表明，所测样品线粒体基因，如COI、Cytb，AT/GC 含量相比，AT显著高于GC，结果符合昆虫线粒体基因AT碱基偏嗜特性。

表4 核苷酸使用频率统计Tab.4 Nucleotides frequency statistics

2.4 系统进化树构建与分析

将获得的该虫蛹和成虫样本的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII序列在NCBI中进行比对，可获得得分高低和相似度高低排列表，结合GenBank 中下载与该虫相应序列相似性较高的相关序列，用 ClustalX1.83 软件去除相似性较差区域，用MEGA6.0构建该虫科部分属种ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、COI-5′、COI-3′、COII相关序列的NJ系统树。系统树分析表明，该虫相关序列与所属更高阶元的某些种类较为亲近，说明该类序列是该虫相关序列，同时通过聚类不同序列反应得出了相应亲缘关系。

3 讨论

3.1 分子鉴定的基础

DNA条形码技术克服了形态学鉴定在实际应用中的诸多局限，弥补了传统的昆虫鉴定方法的不足之处，为种类鉴定提供了简单快速准确的鉴定方法，同时为分类学家鉴定和发现复合组(体)、种团和近缘种提供了新方法。虽然形态学鉴定在实际应用中存在诸多局限，但是脱离了形态分类，以引物检索设计为基础的DNA条形码技术将无法进行，即形态分类的大致类群是设计和检索扩增DNA条形码序列引物的基础。因此利用分类学特征(外在形态特征，如形状、大小、颜色等)对物种进行初步鉴定后，再结合DNA条形码鉴定是更加高效准确的鉴定方法。

3.2 引物与序列分析

检索并设计特异性引物是获得目标核酸片段的基础。本研究中检索或设计的CYT-B、COI基因引物为每个基因2对，均能实现有效扩增，表明这4对引物都可以用来对该物种进行快速鉴定，不同长度(CYT-B)不同部位(COI)携带的信息量不同，但都能用于该物种的快速鉴定。

核酸使用率统计表明，ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII基因序列的AT含量明显高于GC含量，表现明显的A+T碱基偏嗜，且A与T含量相当，符合昆虫线粒体基因碱基组成的基本特征。对本文所获得的各个基因序列分析表明，这些基因序列均能在分子水平上对枣咔实蝇进行检测分析。

虽然未找到多个基因的相似序列，但本文中枣咔实蝇蛹和成虫样品的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII序列分别均为单个同一样品蛹或成虫中获得，在COI-5′获得鉴定结果以后，可有确定他们都为该虫的新序列。在COI获得鉴定结果以后，其他序列也是从该昆虫样品中获得序列，因此获得了多条其他条形码序列，且获得的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII新序列较多。

3.3 分子鉴定结果

在NCBI 网站上运行BLAST程序，鉴定结果如表3所示，COI-5′、COI-3′基因相似度大于98%，能够实现准确鉴定；依据COI-5′基因，枣咔实蝇蛹和成虫样品在BOLD中被鉴定为：枣咔实蝇Carpomyavesuviana，BIN ID:BOLD:ACH5208。通过表3中ITS2、CYT-B-C、CYT-B-D、COII基因比对数据分析可知，相似性较低，通过COI-5′基因已经证明为枣咔实蝇样品，通过相关基因且未能识别为枣咔实蝇样品，说明枣咔实蝇的该类基因核酸数据在NCBI数据库中较少。数据库中无相似数据，说明该核酸序列为新序列，新的核酸序列经常出现，说明数据库中该物种的序列不够丰富(如文中COII等)，基因序列相似度较低，无法实现快速鉴定。

在对昆虫进行分子鉴定时，新核酸序列、首次分子数据传入的重要性等情况需要悉知。未经过权威形态鉴定，将首次获得核酸序列传入数据库中，造成后续研究者错误比对鉴定错的情况是存在的，因此首次提供的分子数据对标本进行准确形态鉴定是非常重要的，这样获得的分子数据才会对后续的分子鉴定有指导意义。

3.4 系统进化树构建

从分子系统树可以看出，本实验样品的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、COI-5′、COI-3′、COII序列均和昆虫相关序列具有很高的相似性，并且和已知的该虫或相近种属相关序列以较高置信值聚在一起，数据比对和建树聚合结果均显示该类样品基因序列可从分子水平对该虫进行分析鉴定。

数据库信息数据量在分子系统学中的重要地位。CYT-B-C、CYT-B-D为CYT-B不同长度对比，通过表3中CYT-B-C、CYT-B-D相似度、覆盖度数据和NJ系统进化树(CYT-B-C未构建)分析可知，CYT-B-C虽然核酸序列信息丰富，但是数据库中数据相对缺乏，不能充分发挥利用该基因的鉴定效果；CYT-B-D核酸序列信息较CYT-B-C相对少了很多，但系统进化鉴定指示信息明确，这说明一定长度的核酸序列已经还有了足够能够鉴定物种的数据；由于数据库中CYT-B-D核酸序列信息丰富，能够将该虫的CYT-B-D基因序列聚为一簇，发挥了较好的鉴定适用性，这说明数据库中该类数据量越丰富越有利于物种鉴定。

不同基因适用于不同阶元的分类研究。从ITS2、CYT-B-C、CYT-B-D、COII、COI-5′、COI-3′基因和序列NJ系统树可以看出，该类昆虫能将种阶元的样品聚在成一簇，说明该类基因适用于该类昆虫分种研究。通过图2中多个基因 NJ系统进化树分析可知，该类枣咔实蝇样本的多个基因序列与Rhagoletis亲缘关系较近。从16SrRNA基因NJ系统树可以看出，该类昆虫属及以上阶元聚为一簇，说明该类基因可以用于鉴定该类昆虫属及以上阶元的分类研究。

图2 枣咔实蝇种类鉴定靶标序列的NJ 分子系统树Fig.2 NJ phylogenetic tree of identical sequences from related species of Carpomya vesuviana图中数字表示置信度；本文的样本用实心三角标出. A: ITS2; B: COI-5′; C: COI-3′; D: COII; E: 12S rRNA; F: 16S rRNA; G: CYT-B-D.Integer indicates bootstrap confidence values，and samples in this study were marked in solid triangle. A: ITS2; B: COI-5′; C: COI-3′; D: COII; E: 12S rRNA; F: 16S rRNA; G: CYT-B-D.

可以通过种群关系推断害虫传播路径。通过图2-C与枣咔实蝇相关的部分种类的COI-3′基因 NJ 分子系统树可以说明，本研究截获的枣咔实蝇样本与北疆的样本关系较远，与来自伊朗的实蝇样本亲缘关系较近，与阿地力·沙塔尔(2008)的研究结果中的KSS样本较为一致，提示KSS样本不是从吐鲁番传入南疆，可能是从伊朗或者其他的路线侵入我国，需要加强监测预警，警惕传入和扩散风险。

本研究利用DNA分子鉴定技术，结合形态学分类方法，通过提取该虫DNA，检索适用于该虫相关基因扩增的引物进行PCR扩增并测序，获得了枣咔实蝇的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII的序列，序列比对和NJ树分析表明这些序列都可作为该虫DNA分子鉴定靶点；对于某些适合种群演变关系研究的基因，如COI不仅能够对种就行有效鉴别，而且可以对种群亲缘关系远近进行分析，为种群入侵或传播途径提供依据；该研究获得的DNA分子特征,丰富了文中该虫基因序列的数据库，为快速鉴定提供多条新的参考序列，为该虫快速鉴定、预警防控和早期防治提供基础数据。